高效液相色譜法同時測定追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷含量*

江 濤，陳麗斯，彭紅英，唐冬蘭，曾 晨，蘇銳輝，湯迎湛，曾利杰

（廣州白云山敬修堂藥業股份有限公司，廣東 廣州 510130）

追風透骨丸由制川烏、香附（制）、川芎、制草烏、麻黃、秦艽、赤芍、天麻、防風等23 味中藥材組方，具有祛風除濕、通經活絡、散寒止痛功效，用于治療風寒濕痹、肢節疼痛、肢體麻木。質量標準收載于2020 年版《中國藥典（一部）》［1］，但含量測定項僅測定芍藥苷的含量。對于含23味中藥材的成方制劑，該質量標準較簡單，檢測指標較局限，無法全面控制產品質量。秦艽為方中臣藥，始見于《神農本草經》［2］，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效［3-6］，主要活性成分龍膽苦苷具有抗炎、鎮痛等藥理作用［7-12］。中藥方劑由多味中藥組成，共同發揮治療作用［13］，強調從整體上發揮作用，僅靠單一成分的檢測不能反映藥品實際質量。多指標成分質量控制模式已廣泛應用于中藥及中藥制劑，尤其是中成藥復方制劑［14］。為保證藥品質量的穩定、均一、可控，本研究中建立了同時測定追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷2種活性成分含量的高效液相色譜法，以完善其質量控制標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有G1311C 型四元梯度泵、G1322A 型在線真空脫氣機、G1329B 型自動進樣器、G1316A 型柱溫箱、G1315D 型二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent Technologies 色譜工作站；KQ-600DE 型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為480 W，頻率為40 kHz）；XA105 型電子分析天平（精度為十萬分之一），ME204T型電子分析天平（精度為萬分之一），均購自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號為110770-201716，含量為97.6%），芍藥苷對照品（批號為110736-201539，含量為96.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；追風透骨丸（廣州白云山敬修堂藥業股份有限公司，批號分別為A11063，A11064，A11065，A11066，A11067，A11068，A11069，A11070，A11071，A12072，A12073，A12074）；甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇- 0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，龍膽苦苷峰和芍藥苷峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液制備

分別取龍膽苦苷對照品、芍藥苷對照品各適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL 含龍膽苦苷和芍藥苷各40 μg 的混合溶液，即得混合對照品溶液。取樣品適量，研成細粉，過65 目篩，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率為480 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方和生產工藝分別制備缺秦艽、缺赤芍、缺秦艽和赤芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1. 龍膽苦苷 2. 芍藥苷A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C-E. 陰性對照品溶液（分別缺秦艽、赤芍、秦艽和赤芍）圖1 高效液相色譜圖1.Gentiopicroside 2.PaeoniflorinA.Mixed reference solution B.Test solution C - E.Negative reference solution（lacking Gentianae Macrophyllae Radix alone，Paeoniae Radix Rubra alone，both Gentianae Macrophyllae Radix and Paeoniae Radix Rubra，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取龍膽苦苷對照品和芍藥苷對照品各20 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，作為對照品貯備液，分別精密吸取上述對照品貯備液1，2，3，5，7，10 mL，置25 mL容量瓶中，加60%甲醇定容，搖勻，配制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y龍= 16.837X龍- 1.848 8（r=0.999 9，n=6），Y芍=26.624X芍+10.640（r=0.999 9，n= 6）。結果表明，龍膽苦苷、芍藥苷質量濃度分別在15.718～157.175 μg/ mL 和16.095～160.949 μg/ mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果龍膽苦苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.35%和0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為A11071）粉末1.0 g，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果龍膽苦苷、芍藥苷含量的RSD分別為0.48%和0.37%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗下供試品溶液適量，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果龍膽苦苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.51%和0.83%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量（含龍膽苦苷0.867 mg/g、芍藥苷1.225 mg/g）的樣品（批號為A11071）粉末0.4，0.5，0.6 g，各3份，精密稱定，分別精密加入2種對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取12 批樣品粉末各2 份，每份1.0 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品中龍膽苦苷和芍藥苷的含量。結果樣品中龍膽苦苷和芍藥苷的平均含量分別為0.856，1.174 mg/ g，RSD分別為5.24%，1.91%。詳見表2。

表2 追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gentiopicroside and paeoniflorin in Zhuifeng Tougu Pills（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

預試驗中，供試品溶液的制備考察了超聲提取和加熱回流提取2種方式，并在此基礎上采用三因素三水平的正交試驗考察甲醇體積分數（40%，60%，90%），提取時間（15，30，45 min），溶劑體積（25，50，75 mL）對供試品溶液提取效果的影響。結果表明，加熱回流提取與超聲提取對含量測定結果影響不大，故選擇操作方便的超聲提取。正交試驗結果顯示，對提取得率的影響因素從大到小為甲醇體積分數＞溶劑體積＞提取時間，最佳提取條件以60%甲醇25 mL、超聲提取30 min為宜。由最佳提取條件制備的供試品溶液的主峰峰面積較大，峰形較好，故最終確定2.2項下供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件選擇

考察了甲醇與不同體積分數醋酸（0.1%，0.3%，0.5%）和不同體積分數磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）組成的流動相，不同柱溫（26，30，35 ℃），不同檢測波長（230，254 nm），不同品牌色譜柱［Thermo Scientific ODS - 2 HYPERSIL C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Phenomenex synergi C18柱（250 mm×4.6mm，4 μm），Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］等對供試品溶液色譜峰分離效果的影響。結果表明，以2.1 項下色譜條件進樣測定時，龍膽苦苷和芍藥苷色譜峰峰形均良好，主峰與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5。

3.3 結果分析

本研究中測定了12 批樣品中龍膽苦苷、芍藥苷2 種成分的含量，結果表明，各批樣品中龍膽苦苷含量差異相對較大（RSD= 5.24%），芍藥苷含量差異較小（RSD=1.91%），究其原因可能為不同批次秦艽的質量差異導致。中藥材質量的影響因素較多，自然環境因素與人工干預因素如土壤、光照、環境溫度、降水量、農藝措施、采收時間、藥材初加工、儲運方式、藥材摻假等對中藥材品質的影響最大［15］。故制訂追風透骨丸中2 種指標成分的合理限度時仍需參考更多批次樣品的含量測定數據及藥品的穩定性試驗考察數據。

3.4 方法評價

所建立的方法操作簡便、結果準確、重復性及專屬性均良好，能更全面地控制追風透骨丸的質量。