高效分子排阻色譜法測定涉藥品不良反應注射用曲克蘆丁中多糖和蛋白類大分子物質

張 琪，于德志，高 倩，李會輕，楊 釗

（山東省青島市食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局海洋中藥質量研究與評價重點實驗室，山東 青島 266071）

曲克蘆丁是在槐米等植物部位提取的蘆丁經羥乙基化制成的半合成黃酮類化合物，常用于抑制紅細胞和血小板凝聚，防止血栓形成，改善微循環，增加血氧含量，促進新血管形成及側支循環建立，保護血管內皮細胞，降低毛細血管通透性［1-2］等，也常用于治療缺血性腦血管靜脈炎及血管通透性增高所致水腫、骨關節炎等癥［3-4］。臨床應用時監測到3 批注射用曲克蘆丁的藥品不良反應（ADR）聚集性信號，患者均有寒戰、發熱（體溫最高39.3 ℃）等臨床表現，并偶見血壓降低等過敏性休克。監管部門懷疑該品種存在熱原反應風險，但按其現行質量標準［5］檢驗，細菌內毒素低于標準規定限度，且其他質量標準項目均符合規定。故對3 批涉ADR和3 批正常注射用曲克蘆丁制劑進行了一系列質量安全性再評價。先進行了內毒素動態濁度法研究，3 批涉ADR 樣品中有2 批的內毒素含量高于同測的3 批正常樣品的10 倍，且接近限值，質量風險差異明顯［6］。在此基礎上，基于ADR 報告提及的過敏性休克及呼吸困難癥狀，進行了2020 年版《中國藥典（四部）》豚鼠主動過敏反應研究［7］，結果均為陰性。考慮到該方法靈敏度較差，又采用了較高靈敏度的直接多肽反應試驗（DPRA）［8］對本次涉ADR 制劑進行了致敏性預測研究，結果均為陰性。DPRA 多用于預測小分子致敏，存在一定局限性，且有研究報道中藥注射劑在輸液過程中有微粒增加嫌疑，而微粒異物也是熱原樣反應和過敏反應等發生的原因［9-11］。曲克蘆丁的制備具有天然產物來源特性，使其易殘留大分子物質，故本研究中建立了高效分子排阻色譜（HPSEC）法對涉ADR 注射用曲克蘆丁中多糖和蛋白類大分子物質進行篩查，以分析ADR 發生原因。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 series 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有示差折光檢測器和紫外檢測器；BT125D 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司）；CF16RXⅡ型多用途離心機（日本Hitachi公司）。

1.2 試藥

注射用曲克蘆丁（規格為每支0.1 g，涉ADR 批號分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407，正常批號分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207），曲克蘆丁原料藥（批號為YL-417），四羥乙基蘆丁（單獨制備，批號為4Q-016），均由國內A 公司提供；曲克蘆丁原料藥（國內B公司，批號為XD-081）；右旋糖酐對照品［批號為140637 - 646 - 201203，D6（Mp 64 650），D7（Mp 135 350），D8（Mp 300 600）］，核糖核酸酶A（批號為140653 - 201806，Mp 13 700），人胰島素（批號為140654-201806，Mp 5 808），胸腺肽α1（批號為140655-201806，Mp 3 108），生長抑素（批號為140656-201806，Mp 1 638），均購自中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（BSA，Solar Life Science，批號為929F052，相對分子質量為66 000）；乙腈、三氟乙酸（美國Thermo Fisher公司）；甘露醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 多糖檢測

2.1.1 色譜條件

色譜柱：TSKgel G4000PWXL 凝膠柱（300 mm ×7.8 mm，10 μm）；檢測器：示差折光檢測器；流動相：純化水；流速：0.5 mL/ min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL（對照品溶液），50 μL（供試品溶液）。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取右旋糖酐對照品（D6，D7，D8）適量，精密稱定，分別加水制成質量濃度為1 mg/mL 的溶液，備用。

供試品溶液：取樣品1支，加水3 mL使溶解，取1 mL，置3 000 Da 超濾離心管中，離心（轉速為7 450 r/ min，溫度為19 ℃）40 min，取出離心管，去除下層液體，上層液體用3～5 mL水沖洗（用移液槍吹打混勻），再離心35～40 min，重復2～3次，直至下層液體Molish反應呈陰性，將上層超濾管中的殘留液體用水定容至5 mL，待測。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：吸取2.1.2 項下對照品溶液適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果右旋糖酐對照品（D6，D7，D8）保留時間（tR）分別為17.690，16.481，15.473 min。以對照品相對分子質量的對數（Y）為縱坐標、tR（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= - 3.316 3X+ 33.594，R2= 0.994 5。結果表明，右旋糖酐的相對分子質量在64 650～300 600 范圍內與tR線性關系良好。

檢測限確定：取右旋糖酐對照品（D6）適量，精密稱定，加水制成質量濃度為0.102 mg/mL 的溶液，逐級稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3∶1時的進樣量確定檢測限。結果檢測限為0.102 μg。

精密度試驗：取2.1.2項下右旋糖酐對照品（D6）溶液適量，按2.1.1項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄tR。結果的RSD為1.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2 項下右旋糖酐對照品（D6）溶液適量，分別于0，2，4，6，8，12 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄tR。結果的RSD為1.76%（n=6），表明待測溶液在12 h內穩定性良好。

2.1.4 樣品中多糖測定

分別取涉ADR（批號分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407）和正常（批號分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207）樣品，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄tR和峰面積。結果6批制劑均在15.5 min出現1個吸收峰，經比較發現該樣品峰與右旋糖酐對照品（D8）吸收峰（tR=15.473 min，峰面積為223 345.0）的位置基本一致，表明樣品中所含多糖類大分子物質的相對分子質量約為300 000。從樣品的tR和峰面積看（表1），涉ADR 樣品與正常樣品的數據無明顯差異，表明涉ADR樣品發生質量安全風險的原因與多糖類大分子物質無關。同法測定甘露醇，發現于15.5 min出現1個吸收峰，與樣品峰基本重合，可見該峰很有可能由輔料甘露醇引入。涉ADR 樣品（批號為ADR-206）、正常樣品（批號為NORM-106）、甘露醇、右旋糖酐對照品（D8）的HPLC圖見圖1。

圖1 涉ADR樣品（批號為ADR-206）、正常樣品（批號為NORM-106）、甘露醇及右旋糖酐對照品（D8）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ADR-related samples（batch number：ADR-206），normal samples（batch number：NORM-106），dannitol and dextran（D8）reference substance

表1 涉ADR樣品、正常樣品的保留時間和峰面積Tab.1 Retention time and peak area of ADR - related and normal samples

2.2 蛋白檢測

2.2.1 色譜條件

色譜柱：TSKgel G2000SWXL 凝膠柱（300 mm ×7.8 mm，10 μm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.05，V/V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：214 nm；進樣量：10 μL（對照品溶液），50 μL（供試品溶液）。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取生長抑素、胸腺肽α1、人胰島素、核糖核酸酶A 各1 mg，精密稱定，分別置5 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得。取BSA 1 mg，精密稱定，加水制成質量濃度為0.1 mg/mL的溶液。

供試品溶液：取樣品1支，加水3 mL使溶解，取1 mL，置3 000 Da 超濾離心管中，離心（轉速為7 450 r/ min，溫度為19 ℃）40 min，上層液體約剩余400 μL，加水3～5 mL 沖洗（用移液槍吹打混勻），棄去下層液體，再離心35～40 min，重復2～3 次，直至下層液體Molish 反應陰性，將上層超濾管中的殘留液體定容至5 mL，即得。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：吸取2.2.2 項下對照品溶液各適量，加水稀釋成一定濃度的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果BSA、核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺肽α1、生長抑素的tR分別為6.927，8.141，9.003，9.811，10.252 min。以對照品相對分子質量的對數（Y）為縱坐標、tR為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= - 2.129 3X+ 17.100 1，R2= 0.991 7。結果表明，蛋白類大分子物質的相對分子質量在1 638～66 000范圍內與tR線性關系良好。

檢測限確定：取生長抑素對照品，精密稱定，加水制成質量濃度為0.177 mg/ mL 的溶液，混勻，逐級稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）為3∶1時的進樣量確定檢測限。結果檢測限為0.003 6 μg。

精密度試驗：精密量取質量濃度為1 mg/mL 的核糖核酸酶A 對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄tR。結果的RSD為0.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取質量濃度為1 mg/mL 的人胰島素對照品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄tR。結果的RSD為0.42%（n=6），表明待測溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.4 樣品中蛋白測定

分別取涉ADR（批號分別為ADR-007，ADR-206，ADR-407）和正常（批號分別為NORM-106，NORM-107，NORM-207）樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖2），涉ADR的3批樣品的吸收峰面積均顯著高于3批正常樣品，核糖核酸酶A對照品的tR為8.141 min，峰面積為3 139.041 3。由表2 可知，涉ADR 樣品中蛋白類大分子物質的含量為正常樣品的3倍，樣品中所含蛋白類大分子物質的吸收峰與核糖核酸酶A對照品峰tR相近，推測涉ADR 樣品中蛋白類大分子物質的相對分子質量約為13 700。

S. 核糖核酸酶A對照品溶液 A - F. 供試品溶液（批號分別為ADR - 007，ADR-206，ADR-407，NORM-106，NORM-107，NORM-207）圖2 高效液相色譜圖S.Ribonuclease A reference solution A-F.Test solution（batch numbers：ADR - 007，ADR-206，ADR-407，NORM-106，NORM-107，and NORM-207，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

表2 涉ADR樣品、正常樣品的保留時間和峰面積Tab.2 Retention time（tR）and peak area of ADR - related and normal samples

為進一步考察注射用曲克蘆丁制劑原輔料中蛋白類大分子物質的含量，取2 批（批號分別為YL - 417，XD-081）原料藥、1批四羥乙基蘆丁（批號為4Q-016），加入甘露醇和BSA 對照品，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖3）、tR及峰面積（表3）。可見，制劑對應原料廠家的曲克蘆丁原料藥中蛋白類大分子物質的含量遠高于同測第三方廠家的20 倍；四羥乙基蘆丁中蛋白類大分子物質的含量遠低于曲克蘆丁原料藥，可能與單獨小批量生產質量控制嚴格有關；甘露醇同條件下蛋白類大分子物質的含量也極低，此處無參考價值。從吸收峰tR來看，2 批曲克蘆丁原料藥及四羥乙基蘆丁中吸收峰位置的蛋白類大分子物質的相對分子質量均小于BSA的66 000，大于核糖核酸酶A的13 700。

A.BSA B. 核糖核酸酶A對照品 C，D. 曲克蘆丁原料藥（批號分別為YL-417，XD-081） E. 甘露醇 F. 四羥乙基蘆丁（批號為4Q-016）圖3 原輔料與對照品溶液高效液相色譜圖A.BSA B.Ribonuclease A reference substance C，D.Raw material of troxerutin（batch number：YL-417，XD-081） E.Mannitol F.Tetrahydroxyethyl rutin（batch number：4Q-016）Fig.3 HPLC chromatograms of raw materials and reference solution

表3 原輔料與對照品的保留時間和峰面積Tab.3 Retention time（tR）and peak area of materials and reference materials

3 討論

注射用曲克蘆丁為中藥注射劑，其主成分曲克蘆丁有天然產物來源特性，制備過程中易引入大分子物質。大分子物質通過靜脈直接進入體內后有足夠時間與免疫細胞直接接觸而激活免疫反應，形成抗原，且分子量越大，抗原性越強。注射用曲克蘆丁制劑有效成分曲克蘆丁相對分子質量為742.69，輔料甘露醇相對分子質量為182.172，均小于1 000，而該品種現行法定質量標準中無大分子物質質控指標，不排除涉ADR 批次注射用曲克蘆丁過敏性休克等為致敏作用引發的可能性，故本研究中對該制劑及其原輔料中大分子物質進行了測定與分析。

首先，采用HPSEC 法測得注射用曲克蘆丁涉ADR樣品中所含蛋白類大分子物質明顯高于正常樣品，其相對分子質量大于13 700，遠大于主成分和輔料的相對分子質量，按峰面積算約為正常樣品含量的3 倍。進一步對原輔料大分子物質進行分析發現，涉ADR 樣品對應原料廠家提供的曲克蘆丁原料藥蛋白類大分子物質含量遠高于第三方廠家提供原料藥的20 倍，且其相對分子質量在13 700～66 000 范圍內。綜合考慮，可基本確認注射用曲克蘆丁制劑發生ADR 的原因為產品中蛋白類大分子物質含量偏高所致，且含量偏高可能由其原料藥導致，同時生產中活性炭及微孔濾芯等關鍵環節大分子物質去除工藝也存在缺陷。絕大多數蛋白質是很好的抗原［12］，但大分子蛋白可升高組胺等活性介質水平而誘發過敏［13-14］。結合前期研究涉ADR 樣品中細菌內毒素含量偏高，不排除樣品中測得大分子蛋白質結構可能類似內毒素，引發熱原或類熱原效應。

藥品生產各環節的質量控制和驗證都是極關鍵的步驟。大分子物質的控制必須保證入廠原輔料質量把關、生產工藝品控關鍵點應有效。注射劑大分子物質臨床應用時直接進入血液，極可能導致速發型超敏反應［15］，但高分子雜質具有高度不均一性和不確定性，且其本身不穩定，去除和定量均存在難度。針對產生該狀況的原因，原輔料入廠質量把關及生產工藝中各環節關鍵點的質量控制至關重要。原輔料入廠時應建立適宜大分子物質的測試方法，嚴把質量關；實際生產過程中，活性炭吸附［16］或兩級微孔超濾系統［17］是去除大分子物質的主要環節，故應關注生產環節活性炭吸附率是否達標或去除干凈［18］，超濾是否及時更換或有無漏點，驗證工作是否滿足質控要求。著力改進、優化生產工藝流程對去除大分子物質、減少注射劑過敏反應有積極意義［19］，生產中宜對中間產品和終端產品就大分子物質建立適宜的測試方法進行質量把控或風險評估。