通脈降濁顆粒質量標準研究*

張賀廷，李 磊△，楊 永，王洪強，丁小凡

（1. 安徽省阜陽市中醫醫院，安徽 阜陽 236025； 2. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012； 3. 安徽省阜陽市食品藥品檢驗檢測中心，安徽 阜陽 236069）

通脈降濁顆粒由丹參、半夏、制首烏、山楂、決明子、蒼術、膽南星、絞股藍、姜黃等12 味中藥組方，具有活血化瘀、降濁祛濕、清熱益腎功效，臨床用于痰濁瘀阻所致眩暈、胸悶、乏力、口干口苦、肢體困重、舌苔黃膩或黃白相兼，有齒痕、瘀點，脈滑、弦等癥。方中君藥丹參活血化瘀、通經止痛、活血行氣，為治療血證的要藥，治療瘀阻心脈、胸痹心痛療效較好［1］?，F代藥理學研究表明，丹參具有保護心血管、抗動脈粥樣硬化、調血脂等作用［2-4］，所含丹酚酸B 具有抗心肌缺血、抗氧化活性［5］及抑制千里光堿所致肝毒性等［6］。決明子有調血脂、保肝、明目功效［7］，其中的橙黃決明素是一種潛在的血管擴張劑［8］，熱裂解酶水解物具有抗高血壓作用［9］。姜黃、山楂具有活血化瘀、行氣溫中功效，姜黃中的姜黃素具有調血脂、抗氧化功效［10］。蒼術、決明子、絞股藍、膽南星、干姜、黃連具有化濕健脾、降濁祛痰等功效，絞股藍有較強的調血脂作用［11-12］，黃連中的活性物質小檗堿、黃連素等具有較強的降血壓、調脂、抗炎活性，還有誘導血管擴張的作用［13］；膽南星中的活性物質有膽汁酸、黃酮等，有保護肝功能的作用［14］；干姜主要活性物質6- 姜酚等物質具有抗炎、降壓功效，以上藥物均為臣藥。制首烏清熱益腎，杜仲具有補肝腎、養筋骨、降血壓功效，均為佐藥。為了有效控制通脈降濁顆粒的質量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中丹參、決明子、姜黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定丹參中丹酚酸B 的含量，為其質量標準的建立提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD - 10A 型檢測器；Scanner - 3 型薄層掃描儀（瑞士Camag 公司）；ME55 型分析天平（梅特勒-托利多有限公司，精度為十萬分之一）；JK-DY300型超聲波清洗器（合肥金克尼機械制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

丹參對照藥材（批號為120923 - 201816），決明子對照藥材（批號為121011 - 201506），姜黃對照藥材（121188 - 201605），丹酚酸B 對照品（批號為111562 -201916，純度為96.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；通脈降濁顆粒（醫院制劑，批號分別為20200513，20200514，20200515，20200601，20200602，20200603）；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

丹參［15-17］：取樣品（批號為20200513）5 g，研細，加入30 mL乙醇超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取丹參對照藥材0.5 g，加10 mL 乙醇，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取丹酚酸B 對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（3∶2∶4∶2∶0.5，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1 - 3. 供試品溶液 4. 對照藥材溶液 5. 對照品溶液 6. 陰性對照品溶液A. 丹參（254 nm） B. 決明子（365 nm） C. 姜黃（365 nm）圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（254 nm） B.Cassiae Semen（365 nm） C.Curcumae Longae Rhizoma（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

決明子［18-19］：取樣品（批號為20200513）5 g，研細，加30 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL 使溶解，用鹽酸調pH 至2，加乙酸乙酯萃取2 次，每次20 mL，合并有機相，揮干，加1 mL 乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺決明子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取決明子對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

姜黃［20-22］：按丹參TLC 鑒別項下方法制備供試品溶液。按處方工藝制備缺姜黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取姜黃對照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷- 甲醇- 甲酸（96∶4∶0.7，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 丹酚酸B 含量測定

2.2.1 色譜條件［23-24］與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL。理論板數按丹酚酸B峰計應大于3 000。

2.2.2 溶液制備

取丹酚酸B對照品16.25 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，制成質量濃度為0.162 5 mg/mL的對照品溶液。取裝量差異項下的樣品，研細，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應吸收峰，且丹酚酸B分離度及拖尾因子均符合要求，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

1. 丹酚酸BA. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.Salvianolic acid BA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2.2 項下丹酚酸B 對照品溶液0.5，1，2，4，8，16 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=10 988X+28 600（r=0.999 9，n=6）。結果表明，丹酚酸B進樣量在0.081 25～2.600 00 μg 范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.2.2 項下對照品溶液（質量濃度為40.72 μg/mL），按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果丹酚酸B 峰面積的RSD為0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20200513）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果丹酚酸B峰面積的RSD為0.24%（n=5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20200513）樣品6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果丹酚酸B平均含量為1.35 mg/ g，RSD為1.97%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為20200513）樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入丹酚酸B（質量濃度為40.72 μg/ mL）對照品溶液50 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定與含量限度

含量測定：取6 批（批號分別為20200513，20200514，20200515，20200601，20200602，20200603）樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算含量。結果6 批樣品中丹酚酸B 含量分別為每袋18.62，19.18，20.30，13.44，12.87，14.70 mg。

含量限度：根據2020 年版《中國藥典（一部）》記載，由丹參中丹酚酸B（丹酚酸B 含量不低于3.0%）含量計算通脈降濁顆粒中丹酚酸B 最低理論值為每袋28.14 mg，以水煎液中轉移率最低32%計算，丹酚酸B含量每袋不低于9.0 mg?？紤]到丹酚酸B在水中的溶解度及實際生產中可能的損耗及藥材批次間的差異，結合實際測量值，最終擬訂每袋含丹參以丹酚酸B含量計不少于10.0 mg。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

在對通脈降濁顆粒中12種主要物質進行TLC 鑒別發現，通脈降濁顆粒中姜黃、決明子、丹參藥材的TLC斑點清晰，陰性對照無干擾。但顆粒中蒼術的TLC 鑒別結果顯示，薄層色譜對應位置無蒼術對應TLC 斑點。查閱文獻［25 - 26］發現，蒼術中主要TLC 鑒別物質蒼術素在高溫加熱過程中易揮發，在TLC 鑒別過程中會有斑點不清晰或無斑點的情況。本研究中通過優化蒼術TLC 鑒別方法，仍未能檢測到其TLC 斑點?？紤]到我院制劑室中藥顆粒劑提取設備采用蒸汽發生器供氣，設備功率較小，提取濃縮過程耗時較長，該制劑在制備過程中經高溫水煮后可能導致蒼術中蒼術素及其他藥材中揮發油類、水溶性物質揮發或分解，從而導致TLC 斑點不清晰或無斑點。

對顆粒劑中山楂、絞股藍、蒼術、膽南星、杜仲、干姜、姜半夏、制首烏等其余藥材進行TLC 鑒別，發現前6 種藥材分離效果較差，且斑點不清晰；制首烏TLC 鑒別中，陰性樣品存在一定干擾，在改變展開劑后仍不能排除陰性干擾，故暫未列入質量標準。

3.2 提取方法選擇

本研究中考察了加熱回流提取與超聲提取對通脈降濁顆粒中丹酚酸B 含量的影響，結果丹酚酸B 含量分別為1.32，1.13 mg/ g，故最終選擇加熱回流提取。同時，考察了不同提取溶劑（75%甲醇、50%甲醇、100%甲醇）及不同取樣量對通脈降濁顆粒中丹酚酚酸B含量的影響，結果顯示，以75%甲醇為提取溶劑時含量最高，取樣量為1.5～2.5 g 時含量差異不明顯。故最終確定2.2.2項下樣品處理方法。

3.3 質量控制

中藥制劑處方藥味較多，其活性物質相對豐富，很難用一種成分衡量其臨床療效，在制訂其質量標準中應用一種或幾種物質也不能完全代表該處方的質量標準。結合中藥傳統的煎煮方法與臨床實際療效，在對其工藝研究與質量標準制訂中考察加水量、煎煮時間與煎煮次數，并結合實際生產情況進行制訂。本制劑在質量控制中以君藥丹參的活性物質為指標，丹參的活性物質包括脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮ⅡA及水溶性成分酚酸類如丹酚酸B、丹參素等，考慮到本制劑以水為溶劑提取，故在質量控制中以水溶性成分相對較穩定的丹酚酸B為主要指標考察［27］。

3.4 方法評價

本研究中建立的定性、定量方法簡便易行、專屬性強、準確度高、重復性好，可用于通脈降濁顆粒的質量控制。