全基因組關聯分析大數據為基礎的孟德爾隨機化方法探究類風濕性關節炎與牙周炎發病風險的因果關聯

許立碩，葛翠翠，劉晨光

（1. 吉林大學口腔醫院急診與黏膜病科，長春 130021；2. 吉林省人民醫院口腔科，長春 130021）

牙周炎（periodontal disease，PD）是口腔最常見的慢性炎癥性疾病，是造成牙齒脫落的主要原因[1]。牙周炎主要受齦下菌斑生物膜的影響，誘導宿主促進炎癥介質的釋放，從而引發慢性炎癥反應，導致牙槽骨的吸收及牙齒的脫落[2]。類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統性自身免疫性疾病，以慢性、對稱性、炎癥性和關節外病變為主要臨床表現，其特征是發病率及致殘率較高、早期癥狀不典型，常可導致漸進性殘疾，引發多種長期并發癥[3]。據報道，牙周炎可能會影響全身的健康，大量的研究已經證明牙周炎與類風濕性關節炎[4]，動脈粥樣硬化[5]，阿爾茲海默癥[6]，慢性阻塞性肺炎[7]等某些全身性疾病關系密切。

有研究[8]表明，盡管類風濕性關節炎和牙周炎的病因不同，但兩者在發病機制方面相似。其表現的慢性炎癥在適應性免疫表型、促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的不平衡方面以及在吸煙和遺傳方面的作用相似，PGE2、IL-1、TNF-α 等這些細胞因子能使組織發生破壞，釋放炎癥細胞因子，進而導致這兩種疾病在骨骼破壞方面具有相似性[9-10]。因此，類風濕性關節炎和牙周炎之間可能存在雙向相互關系。

已經有研究[11-12]表明牙周炎是類風濕性關節炎的危險因素，其中的聯系首先表現在牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）中，P. gingivalis 是牙周炎的致病菌之一，是一種革蘭氏陰性厭氧菌，特征是存在肽酰精氨酸脫氨酶（PAD），這種酶通過催化瓜氨酸化來促進類風濕性關節炎的發育，瓜氨酸化是一種翻譯后修飾，在生產抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）方面發揮著關鍵作用，而ACPA 則被廣泛認為是類風濕性關節炎患者的診斷和預后的生物標志物。此外，大量的回顧性研究證明了牙周炎與類風濕性關節炎之間存在著密不可分的關系。Pischon 等發現，與健康患者相比，牙周炎患者的類風濕性關節炎患病率更高[13]。一項Meta 分析表明，與健康對照組相比，牙周炎患者患類風濕性關節炎的風險更高[14]。

但值得注意的是，在過去的研究中，對于類風濕性關節炎是否影響牙周炎疾病的報道并不是很多，SHAILESH[15]曾經研究得出印度人中類風濕性關節炎患者患牙周炎的幾率更高。在尼泊爾三級醫院中，類風濕性關節炎患者的牙周炎患病率為86.04%[16]。然而這些結論主要來自病例對照或隊列研究，隨機對照等高質量研究卻很少，因此效果估計容易產生偏差。由于傳統觀察設計的內在弱點，依舊無法確定類風濕性關節炎與牙周炎發病之間是否存在因果關系。

傳統的回顧性流行病學調查方式，往往易引起反向因果關系和潛在混雜因素的影響，從而降低了其論證病因假說的能力。孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）利用遺傳變異的自然隨機分配，避免了潛在的混雜因素，為判斷暴露因素與結局之間的因果關系提供了新的思路[17]。在本研究中，設計了一項兩樣本MR 研究來分析全部遺傳數據，以調查東亞人群中類風濕性關節炎和牙周炎疾病之間的潛在因果關系。

1 資料與方法

1.1 研究設計

本研究是一項兩樣本MR 研究，使用GWAS公開匯總統計數據來分析類風濕性關節炎與牙周炎是否存在因果關系。以GWAS 公開發布的人類基因組信息為參照基礎，篩選出了與類風濕性關節炎有關具有重要統計價值的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，作為基因工具變量；然后，再借助另一項GWAS 調查獲得了有關牙周炎的相關信息，從而確定了相關SNP 的存在；最后通過篩查出的SNP，采用多種MR 方法來推測類風濕性關節炎與牙周炎疾病風險之間的關系[18-21]。

1.2 相關數據來源

類風濕性關節炎與牙周炎的關聯GWAS 數據分別來源于英國數據庫MRC-IEU（https：//github.com/MRCIEU）和日本數據庫BioBank Japan Project（BBJ）數據集（https：//biobankjp.org/english/index.html）。MRC-IEU 數據集中類風濕性關節炎的樣本量為22 515 名東亞人，包括4 873 例類風濕性關節炎患者和17 642 例對照人群。BBJ 數據集中牙周炎的樣本量為212 453 名東亞人，包括3 219 例牙周炎患者和209 234 例對照人群。

1.3 相關SNP 篩選

在MR 分析中，暴露數據集中的（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）被用作工具變量（Instrumental variable，IV）。IV 應滿足以下三個基本假設：1）IV 與暴露密切相關；2）IV 與任何潛在的混雜因素無關； 3）除了通過暴露方式外，IV 與結果無關。從GWAS 公開匯總數據中選擇的SNP 應該具有全基因組顯著性（GWAS P value ＜ 5×108）且次要等位基因頻率＞0.01。 為了從GWAS中識別獨立變異，去除了這些SNP 中的連鎖不平衡（R2＜ 0.001 and distance ＞ 10 000 kb），聚集剩余的SNP[22]。使用F 統計值評估每個SNP 的強度（F-statistic= R2 ×（N-2）/（1-R2），R2 = 2×（Beta）2× EAF×（1-EAF）/[2 ×（Beta）2× EAF ×（1-EAF）+ 2 ×（SE）2× N × EAF ×（1-EAF）]，N 代表暴露GWAS 研究的樣本數，R2是IV 解釋暴露的程度（回歸方程的決定系數），Beta 代表每個SNP 和表型關聯的每個等位基因效應大小，SE 代表Beta的標準差，EAF 代表效應等位基因頻率）[23]。F 統計值＜10 的SNP 將被刪除[24]。本MR 研究中只研究了暴露和結果GWAS 數據集中都存在的SNPs，不包括代理SNPs[25-26]。最終篩選出13 個SNP：分別為rs10821944、rs10946216、rs11889341、rs17427599、rs2240339、rs2244020、rs2856821、rs3734708、rs3819720、rs449635、rs58667488、rs909267、rs9494892，納入SNP 的具體信息見表1。

表1 與類風濕性關節炎和牙周炎相關的SNP 的基本特征

1.4 統計學方法

使用Wald 比率來估計每個IV 的因果效應，然后采用逆方差加權（inverse variance weighted，IVW）方法整合每個IV 的效應大小來估計暴露對結果的總體因果效應（P＜0.05）[24]。采用敏感性分析作為IVW方法的補充，包括多效性檢驗、異質性檢驗、逐個剔除檢驗。多效性檢驗主要檢驗多個IV 是否存在水平多效性，常用MR-Egger 法的截距項表示，如果該截距項與0 差異很大，說明存在水平多效性（P＜0.05）[23，27]。異質性檢驗主要是檢驗各個IV 之間的差異，IVW 方法中的Cochran's Q 值用于評估異質性（P＜0.05），如果不同IV 之間的差異很大，則異質性就越大，低異質性為因果效應提供了更高的可靠性[28-29]。逐個剔除檢驗主要是計算逐個剔除某一個IV 后剩下IV 的MR 結果，若剔除某個IV 后其它IV 估計出來的MR 結果和總結果差異很大，那么說明MR 結果對該IV 是敏感的[30]。若不存在水平多效性和異質性則采用IVW 方法的效應估計作為主要效應量；若存在異質性，則采用加權中值方法的效應估計作為主要效應量，加權中值法是利用大部分SNP來判斷因果關系的有無[31]；若存在水平多效性，則采用MR-Egger 方法的效應估計作為主要效應量[24]。

所有統計分析和數據可視化均在R 軟件（version 4.0.0）中進行。使用“Two Sample MR” package 進行單變量MR 分析（version 0.5.6）。

2 結果

2.1 效應分析

森林圖（圖1）顯示，IVW 分析結果顯示兩種疾病存在因果關系，類風濕性關節炎是牙周炎發病風險的危險因素（OR = 0.931，95%CI 0.886 - 0.978，P= 0.005）；為排除混在因素的影響，使用MRegger 回歸方法評估水平多效性，發現不存在水平多 效 性（egger-intercept= -0.005，P= 0.821）。 然后進行了異質性分析，結果顯示不存在異質性（P=0.168），由此說明遺傳多效性不會對本研究結果造成偏倚，結果可靠穩定。

圖1 MR-Egger 回歸法以及IVW 法估計SNP 相關類風濕性關節炎與牙周炎森林圖

加權中值法和MR-Egger 回歸法的結果見表2。為觀察每種評估方法結果的一致性，通過散點圖（圖2）來表示，根據直線斜率判斷，IVW 法、MREgger 法和加權中值法的因果關聯估計相近，說明MR 結果是準確的。

表2 IVW、MR-Egger、WME 回歸的OR 估計值及其95%CI

圖2 類風濕性關節炎與牙周炎的遺傳相關性的散點圖

2.2 敏感性分析

在本次研究中，通過留一法來進行敏感性分析。在每次去除1 個SNP 后，將剩余的12 個SNP 作為基因工具變量再進行IVW 效應分析，進而判斷單獨的SNP 是否會對分析結果產生影響。分析結果發現OR 值均＞1，即本次研究中沒有對因果估計結果產生較大影響的SNP。見圖3。

圖3 留一法敏感性分析結果

3 討論

本研究利用大規模的GWAS 匯總數據及IEU 和BBJ 匯總數據，通過兩樣本孟德爾隨機化的方法探究了類風濕性關節炎與牙周炎發病風險的因果關聯，是首次且最大量的研究來評估東亞人群類風濕性關節炎與牙周炎發病風險之間關系的研究。使用三種不同的估計方法（IVW、Weighted median 法、MREgger 回歸法）進行MR 分析。研究顯示，類風濕性關節炎是牙周炎發病風險的危險因素。

在2012 年之前，有學者已經發表了一些隊列研究來調查類風濕性關節炎與牙周炎之間的關系。在2000－2012 年間發表的8 篇橫斷面研究中，只有一項研究[32]顯示兩者是負面關系，其余7 項報告均顯示類風濕性關節炎患者患牙周炎的風險和流行率較高，反之亦然。另一項研究評估了美國退伍軍人中，與骨關節炎患者相比，類風濕性關節炎患者的牙周炎更常見且更嚴重[33]。但有一項孟德爾隨機化研究的結果與本研究的結果存在矛盾，其研究發現歐洲人群中類風濕性關節炎與牙周炎無明顯因果關系，反向亦之，分析這可能是由于研究人群種族的不同而導致的差異[34]。本研究結果可能不適于其他種族，因此未來的研究需要更大規模的GWAS 匯總數據和更多不同種族的分析。

大量研究也從不同方面對類風濕性關節炎和牙周炎之間的聯系進行分析。在遺傳生物標志物方面，高多態性HLA-DRB1 位點（所謂的共享表位-SE）是參與兩種疾病發展的最強遺傳因素[4]，攜帶rs2237892T 等位基因的人可能同時患有這兩種疾病[35]。在炎癥生物標志物方面，類風濕性關節炎和牙周炎患者都表現出高水平的IL1β，IL6，MMPs和TNF-α。這種促炎細胞因子表達的增加可以刺激STAT3 激活，在類風濕性關節炎和牙周炎的病理生理學中發揮關鍵作用[36]。在自身抗體方面，有證據表明，牙周病原菌P. gingivalis 和伴放線放線桿菌（A.actinomycetemcomitans）是目前參與類風濕性關節炎和牙周炎發病機制的兩種最重要的微生物，與類風濕性關節炎的診斷和預后生物標志物-抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）增加有關[8，11-12]。

本研究通過兩樣本法孟德爾隨機化分析，探究了類風濕性關節炎與牙周炎發病風險的因果關聯，本研究成果具備以下一些優勢：1）本研究成果所納入的數據集總共包含超過23 萬樣本例數，大樣本數據使得統計學的效果更強；2）本研究成果采用了多種MR 統計學方法以及其他敏感性分析方法，其準確的數據結果提高了數據的可靠性；3）與傳統的回顧性研究成果比較，本研究成果更有效地消除了反向因果關系及混雜因子的影響。不過，本研究結果還具有一定的特殊性：1）使用來自IEU 及BBJ 數據庫研究的大量公共數據，所納入的群體大多為東亞國家，實驗結果能否應用到其他種族上，待進一步證實；2）兩樣本MR 分析結果未能對性別進行分組，也未能了解不同性別之間致病力是否有區別；3）類風濕性關節炎與牙周炎可能的生物學機理目前仍未充分清楚，通過本分析僅能對兩者的因果關系做出初步判斷。