高效液相色譜儀測(cè)定大豆油中苯并(a)芘含量的不確定度評(píng)定

◎ 劉 瀛，許文雅，肖舒元，王 韻，郁蕉竹，林 洋

（沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽 110122）

苯并(a)芘（又稱3，4-苯并芘，以下簡稱為BAP）屬于多環(huán)芳烴類化合物（PAHs），它是我們?nèi)粘Ｉ钪邢喈?dāng)常見的一種高活性致癌物，目前已被世衛(wèi)組織確定為三種強(qiáng)致癌物之一[1]。BAP不僅廣泛存在土壤等環(huán)境中，還可能通過食物或飲用水進(jìn)入人體內(nèi)，被人體吸收進(jìn)入腸道，通過血液循環(huán)快速遍布人體各個(gè)部位，對(duì)人們的身體造成嚴(yán)重傷害[2]。

BAP具有較強(qiáng)的脂溶性，這導(dǎo)致大豆油等植物油類食品極易遭受BAP的污染[3-4]，當(dāng)前在國內(nèi)外的植物油樣品中均有檢出BAP[5]。植物油的BAP項(xiàng)目已經(jīng)成為食品中特別關(guān)注的指標(biāo)[6]，GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中明確規(guī)定，油脂BAP的限量指標(biāo)為10 μg/kg[7]。

測(cè)量不確定度是評(píng)定檢測(cè)結(jié)果精度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它能夠直觀地反映測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性與可信度，同時(shí)也對(duì)測(cè)定結(jié)果的判定提供了參考[8]。本文參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27—2016[9]檢測(cè)大豆油中的BAP，并根據(jù)JJF 1059.1—2012[10]對(duì)其測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度的評(píng)定。通過分析致使檢驗(yàn)結(jié)果存在誤差的各種因素，得到各不確定度分量，合成相對(duì)不確定度以及擴(kuò)展不確定度，從而提高大豆油中苯并(a)芘檢測(cè)精準(zhǔn)度，對(duì)提高測(cè)量結(jié)果質(zhì)量等提供指導(dǎo)思路[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BAP標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）：德國DR 公司；大豆油試樣（市售）；BAP分子印跡柱：上海安譜公司；正己烷（色譜純）：Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（色譜純）：Thermo-Fisher公司；乙腈（色譜純）：國藥。

1.2 儀器

電子天平：Sartorius賽多利斯；高效液相色譜儀（E2695配備熒光檢測(cè)器2475）：Waters；多試管渦旋混合器：DMV-16，廣東科寅實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；M64平行濃縮儀：LabTech公司；移液器：德國Brand。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取BAP標(biāo)準(zhǔn)品0.001 03 g于10 mL容量瓶中，用甲苯溶解并定容，此溶液為BAP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（103 mg/L）。用乙腈將儲(chǔ)備液稀釋成1.03 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再用乙腈逐級(jí)稀釋配制成0.515 μg/L，1.03 μg/L，5.15 μg/L，10.3 μg/L，20.6 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取0.500 g試樣，加入正己烷旋渦混勻，轉(zhuǎn)移至已用正己烷和二氯甲烷活化的BAP分子印跡柱，用正己烷淋洗柱子并棄去，CH2Cl2洗脫。收集用氮?dú)獯蹈桑?0.5 mL乙腈復(fù)溶，旋渦后過微孔濾膜待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（88∶12，v/v）；激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min。

2 數(shù)學(xué)模型的建立及不確定度來源分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

BAP含量結(jié)果以μg/kg表示，保留小數(shù)點(diǎn)后一位，其數(shù)學(xué)模型為：

式中，X——樣品中BAP的含量；P——被測(cè)組分濃度（μg/L）；V——定容后的樣體積（mL）；m——所稱樣品重量（g）；1 000為單位換算因子。

2.2 不確定度來源分析

以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)進(jìn)行分析，結(jié)合實(shí)際檢測(cè)步驟，發(fā)現(xiàn)測(cè)定的大豆油BAP含量的不確定度主要來自以下幾個(gè)方面：

①樣品的稱量。②樣品的提取和定容。③標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋。④標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。⑤樣品測(cè)量重復(fù)性。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品稱量引入的不確定度

本方法中稱樣量m樣為0.500 g，根據(jù)所使用的電子天平的檢定證書，其稱量引入的不確定度按B類評(píng)定，則α=0.005 g，屬于均勻分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度；所引入的不確定度分量為：

3.2 樣品定容引入的不確定度

樣品經(jīng)溶劑溶解、分子印跡柱凈化、氮吹濃縮后，最后定容用0.5 mL乙腈，其溫度變化可忽略不計(jì)，根據(jù)其校準(zhǔn)證書（500±5 μL），按均勻分布，則

實(shí)驗(yàn)室溫度20 ℃±5 ℃，在此條件下，乙腈膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，則

由于兩個(gè)分項(xiàng)是獨(dú)立不相關(guān)的，合并兩分項(xiàng)計(jì)算。因此，樣品前處理過程中定容引入的不確定度分量為：

3.3 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度

配制BAP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并逐級(jí)稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液。此操作步驟中的不確定性很大程度上來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制及稀釋過程。

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的分量

BAP標(biāo)準(zhǔn)品證書上注明了其純度為99.03%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=±0.35%（k=2），則

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的分量

由于本實(shí)驗(yàn)室所用電子天平的最大允許誤差為±0.5 e即±0.000 05 g，則α=0.000 05 g。視為均勻分布，稱取BAP標(biāo)準(zhǔn)品0.001 03 g，則

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的分量

3.3.3.1 容量瓶體積引入的不確定度

根據(jù)10 mL容量瓶檢定證書（允差10±0.02 mL），近似于三角形分布（屬B類評(píng)定，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制溫度變化引入的不確定度

根據(jù)容量瓶檢定證書，容量瓶的檢定溫度為24 ℃，本實(shí)驗(yàn)室溫度在20 ℃±5 ℃范圍內(nèi)波動(dòng)。在20 ℃溫度下，玻璃的膨脹系數(shù)值為2.5×10-5/℃，而甲苯的膨脹系數(shù)數(shù)值為1.08×10-3/℃，容量瓶的體積膨脹值要小得多，只需要考慮液體的體積膨脹。因此，體積變化為±10 mL×5℃×1.08×10-3/℃=±0.054 mL，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則10 mL容量瓶引入

因此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程的

3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的分量

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中的不確定度分量主要來自兩個(gè)方面：移液器的使用和容量瓶的引入。

3.3.4.1 移液器（50 μL、200 μL）引入

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋所使用的移液器體積及其相對(duì)不確定度表

3.3.4.2 容量瓶引入

根據(jù)容量瓶的檢定證書，計(jì)算得到容量瓶體積及溫度變化所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。

表2 容量瓶所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

綜上計(jì)算得：

合并兩項(xiàng)計(jì)算，標(biāo)液配制過程所引入的

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的分量

將配制好的BAP標(biāo)準(zhǔn)工作液依次注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1 201 774X+7 295.2，R2=0.999 989。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度及峰面積結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度及峰面積結(jié)果表

式中，n=5，為標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量次數(shù)即曲線濃度點(diǎn)數(shù)。樣品平行測(cè)定6次，質(zhì)量濃度分別為5.882 μg/L，6.005 μg/L，5.622 μg/L，5.954 μg/L，5.771 μg/L，5.582 μg/L，求得平均質(zhì)量濃度為C0=5.803 μg/L，其峰面積殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差及其它相關(guān)數(shù)據(jù)見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)表

則C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5 樣品測(cè)量重復(fù)性因素引起的不確定度

對(duì)樣品重復(fù)稱量6次進(jìn)行平行測(cè)定，結(jié)果見表5。測(cè)定結(jié)果的平均值為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為

表5 苯并(a)芘含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

按A類評(píng)定進(jìn)行計(jì)算，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.6 合成不確定度

3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將各部分分量最終所合成得：

3.6.2 擴(kuò)展不確定度

在95%置信水平下取k=2，擴(kuò)展不確定度

4 結(jié)語

通過對(duì)大豆油中BAP含量的各不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，發(fā)現(xiàn)大豆油中BAP含量為X=（5.7±0.54）μg/kg（P=95%，k=2）。經(jīng)過分析，確定BAP含量測(cè)定過程中可以不確定度的來源主要是試樣稱量、樣品最終的定容操作、配制和稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、測(cè)量重復(fù)性5個(gè)方面，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋以及測(cè)量的重復(fù)性對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)確定度的影響相對(duì)較大。基于此，在實(shí)際檢測(cè)過程中，為了降低測(cè)試的不確定度，需要嚴(yán)格把控檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，選擇等級(jí)較高的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和精度較高的量具，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按時(shí)進(jìn)行期間核查，精確配制和稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液；此外，要加強(qiáng)人員的監(jiān)督和培訓(xùn)，盡量減少人為誤差，同時(shí)注重儀器的維護(hù)與保養(yǎng)，定期進(jìn)行儀器檢定校準(zhǔn)和期間核查，以及增加樣品平行測(cè)定次數(shù)等，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低測(cè)量的不確定度。