大棗多糖提取工藝及抗氧化活性研究

◎ 廉偉偉，王春燕，鄭夢寒，呂雙雙，張會麗

（鄭州工業應用技術學院藥學與化學工程學院，河南 鄭州 451150）

大棗，又被叫做棗子、良棗、刺棗、貫棗、姜棗等，鼠李科植物棗樹的成熟果實就是大棗[1]。截至目前,中國的優良棗樹品種居世界第一，大多數分布在山西、山東、河北、陜西、新疆和河南等地。

研究表明，紅棗含有豐富的維生素P、環磷酸腺苷（cAMP）、維生素C、黃酮類、多糖等[2-3]。其中，大棗多糖具有護肝保肝、抗氧化、提高免疫力、抗炎和抗腫瘤等作用[4-5]。目前，常用的提取方法有水提醇沉法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶提取法[6]等。

大棗多糖具有較強的抗氧化活性，能增強慢性疲勞綜合癥鼠的免疫系統能力和抗氧化能力，而且可作為生物反應調節物[7]。最近研究[8]表明，大棗多糖可以作為天然抗氧化劑使用，相關學者利用化學及生物學方法對大棗多糖抗氧化活性進行評價，包括多糖清除羥基自由基、抑制脂類過氧化等，證實了大棗中含有的多糖有著良好的抗氧化作用，不僅能作為食品食用，還能作為一種身體的調理劑。因此，大棗作為一種藥食兩用的綠色產品，在中國擁有廣闊的市場。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

大棗，產自河南省新鄭市，購買于禹州市信義教學設備有限公司；FW80微型高速萬能試樣粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；SH-Z-D（III）循環水式多用真空泵（鄭州瑞涵儀器有限公司）；202-2型電熱恒溫干燥箱（上海椿拉儀器儀表有限公司）；BK-1000B超聲波清洗儀（濟南巴克超聲波科技有限公司）；UV1700PC紫外分光光度計（上海奧析科學有限公司）；N-1300旋轉蒸發儀（東京理化）；95%乙醇分析純（批號20220105，上海展云化工有限公司）。

無水乙醇（批號20220120， 上海展云化工有限公司）；石油醚（批號220220，上海展云化工有限公司）；苯酚（批號220105，上海展云化工有限公司）；無水葡萄糖（＞98%）標準品（批號B21882，上海源葉生物科技有限公司）；抗壞血酸（99.7%）標準品（批號20220223，天津市光復科技發展有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（97%）標準品（批號20220220，上海展云化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大棗多糖提取工藝

稱取大棗適量，按條件進行提取，提取液濃縮至1∶2（原料重∶溶液體積），醇沉，靜置，離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，經真空干燥，得到粗多糖，接著，計算收率及多糖含量。將大棗去核粉碎，稱取大棗粉，水浴回流脫脂后室溫干燥，干燥大棗粉浸泡1 h，水浴浸提，抽濾，保存濾液，濾渣加入同樣水量，再次浸提，合并兩次所得提取液，濃縮至原提取液1/4，用無水乙醇醇沉，使醇濃度達到80%，經過靜置、離心、沉淀，用無水乙醇、丙酮和石油醚反復洗滌真空干燥，得到大棗粗多糖。

1.2.2 標準曲線的繪制

首先，將約0.025 0 g的葡萄糖標準品精確稱量至25 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，然后將其稀釋至刻度線，以獲得濃度為1.024 mg/mL葡萄糖標準溶液。接著，從配制的葡萄糖標準溶液中，依次吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL溶液至10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。其次，分別取1 mL標準溶液到1、2、3、4、5號試管中，再依次向5支試管中加入5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，再放人沸水煮30 min，30 min后取出，分別從試管中取2 mL樣品加入比色皿。最后，取1.0 mL的蒸餾水按上述的實驗程序進行操作，并將其用作葡萄糖標準溶液的空白對照，于紫外分光光度計490 nm[9]處測定葡萄糖標準溶液的吸光度（A），繪制標準曲線。

1.2.3 穩定性實驗

取濃度為1.024 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.5 mL于10 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線，并混勻，從中取1 mL標準溶液試管中，再依次向5支試管中加入5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，再放入沸水浴30 min后取出，放冷至室溫，從試管中取樣品適量加入比色皿中，同法制備空白對照，室溫放置0、6、12、18、24 h，測定在490 nm處吸光度。

1.2.4 精密度實驗

分別精確吸取六份濃度為1.024 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.5 mL，用蒸餾水定容到10 mL容量瓶中，搖勻待用，然后按1.2.6的試驗程序進行試驗，用苯酚-硫酸法測定吸光度（A）。

1.2.5 重復性實驗

精密稱定6份脫脂后的大棗粉15 g ，按照1.2.6項下實驗過程進行操作，依次制備出6份供試液備用，并按以上方法進行吸光度（A）的測量。

1.2.6 苯酚-硫酸法測定大棗多糖含量

首先用脫脂后的大棗粉15 g（A）進行最佳工藝提取，得到1.7 g（m）大棗粗多糖，其次測定含量,實驗步驟如下：

精確稱量約0.02 g（B）大棗粗多糖至100 mL容量瓶，用蒸餾水溶解后再定容至刻度線，再取出10 mL到100 mL容量瓶，再用蒸餾水定容到刻度線，然后吸取1.0 mL注入試管中，加入1.0 mL的5%苯酚試劑和5.0 mL濃硫酸，搖勻煮沸30 min。用紫外分光光度計法在490 nm處測量吸光度（A），把A值代入2.1項下線性回歸方程中，得到大棗多糖濃度C，按照下列公式（1）計算出大棗粗多糖含量。

D為稀釋體積（mL）；

C為大棗多糖濃度（μg/mL）；

A為大棗脫脂后質量（g）；

B為稱取的大棗粗多糖質量（g）；

m為最佳工藝提取的粗多糖質量（g）。

1.2.7 DPPH法測定大棗多糖抗氧化活性

精密稱定所需試劑1,1-二苯基-2苦肼基自由基（DPPH）約5 mg至100 mL刻度的容量瓶，用無水乙醇溶解稀釋至刻度線，充分振搖，制成DPPH乙醇溶液，濃度為0.055 mg/mL。使用紫外分光光度計在517 nm測VC吸光度（A0）。

將約0.02 g VC精確稱量到25 mL容量瓶，用無水乙醇溶解，然后稀釋到刻度線，充分振搖，然后將VC溶液配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL作為陽性對照。

稱取大棗粗多糖約0.02 g，制成和VC相同濃度的大棗多糖溶液，先分別吸取1 mL不同濃度的多糖溶液于1、2、3、4、5號試管中，于紫外分光光度計517 nm處測量吸光度（A1），再分別向5支試管加入2 mL的DPPH乙醇溶液，最后分別取5支試管中溶液2 mL于比色皿中，30 min后再次測量吸光度（A2）。按照公式（2）分別計算出大棗多糖對DPPH自由基清除率（%），并繪制不同濃度大棗多糖對DPPH自由基的清除作用曲線。

1.3 統計學處理

通過SPSS軟件進行統計學處理，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05具有統計學含義。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以苯酚硫酸法在490 nm處測葡萄糖吸光度，如表1所示。以葡萄糖濃度（μg/mL）作為橫坐標，吸光度（A）作為縱坐標，并繪制葡萄糖標準曲線，如圖1所示，線性回歸方程Y=0.006 6X+0.229 5，相關系數為R=0.999 8，具有良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

表1 葡萄糖標準溶液濃度與吸光度測定數值表

通過重復性穩定性測試，結果葡萄糖標準溶液RSD值為1.08%，供試液在24 h內顯色穩定；重復性測試，RSD值為1.05%，重復性好；精密度測試，其RSD值為1.12%，精密度符合要求。

2.2 大棗脫脂、多糖提取工藝篩選

2.2.1 回流脫脂溶劑的選擇

95%乙醇脫脂的脫脂率（12.75%）＞石油醚脫脂的脫脂率（1.75%），且差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表2。

表2 不同脫脂溶劑脫脂率表（%）（n=3）

2.2.2 超聲輔助脫脂溶劑的選擇

因為P＞0.05，說明不同的脫脂溶劑對于脫脂率均不會表現出差異性。所以，在超聲輔助脫脂時用95%乙醇或者石油醚脫脂都可以，結果見表3。

表3 不同脫脂溶劑脫脂率表（%）（n=3）

2.2.3 大棗多糖工藝篩選

稱取脫脂后的大棗粉15 g，以1∶24的比例加入蒸餾水200 mL，在提取之前浸泡1 h，首先是在88 ℃下進行水浴提取兩次，每次2 h，其次是超聲提取50 ℃下水浴提取兩次，每次30 min，最后濃縮提取液，靜置醇沉、干燥得大棗粗多糖，稱取其重量并計算大棗粗多糖得率。實驗結果表明到95%乙醇回流脫脂后水提平均值（6.35），會明顯高于95%乙醇超聲脫脂后超聲提的平均值（3.45），表明95%乙醇脫脂后水提方法好，粗多糖得率最高，所以選擇95%乙醇脫脂后進行水提的方法，結果見表4、圖2。

圖2 不同提取工藝柱狀圖

表4 不同提取工藝粗多糖得率表（%）（n=3）

2.3 大棗多糖回流提取單因素實驗

在選擇大棗粗多糖提取工藝條件時，主要以料液比、時間和溫度為考察對象，探討這三個因素對大棗粗多糖得率的影響。

2.3.1 料液比對大棗粗多糖得率的影響

稱取脫脂后的大棗粉15 g，設置大棗多糖提取溫度為68 ℃，提取時間為4 h，考察1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30液料比對大棗粗多糖得率的影響，重復3次，進行最佳料液比的篩選。由表5可知，當料液比范圍是1∶6~1∶30時，隨著水量的增加，大棗粗多糖得率也在逐步提高，尤其當料液比為1∶24時，大棗粗多糖得率最高（如圖3所示），所以選擇1∶24的料液比。

圖3 料液比對大棗提取的影響圖

表5 料液比對大棗粗多糖得率的影響數據分析表（n=3）

2.3.2 溫度對大棗粗多糖得率的影響

先稱取脫脂后的大棗粉15 g，然后以2.3.1中篩選的最佳料液比為條件，時間是4 h，設置溫度58 ℃、68 ℃、78 ℃、88 ℃、98 ℃，探究溫度對大棗粗多糖得率的影響，重復3次，進行最佳提取溫度的篩選。由表6可知，大棗多糖溫度范圍是58 ℃~98 ℃，隨著溫度的升高，粗多糖得率呈現一種遞增狀態；當溫度達到88 ℃時，粗多糖得率最高，因此選擇提取溫度88 ℃（如圖4所示）。

圖4 提取溫度對多糖提取的影響圖

表6 提取溫度對大棗粗多糖得率的影響數據分析表（n=3）

2.3.3 時間對大棗粗多糖得率的影響

稱取脫脂后的大棗粉15 g，以2.3.1和2.3.2篩選的最佳料液比和提取溫度為基礎，考查不同大棗多糖提取時間1、2、3、4、5 h對大棗粗多糖得率的影響，重復3次，進行最佳時間的篩選。由表7可以看出，大棗多糖提取時間是從1 h~5 h，在此時間內，大棗粗多糖得率是先升高后降低，在2 h時間段粗多糖得率最高，粗多糖得率最高，所以選擇2 h的提取時間（如圖5所示）。

圖5 提取時間對大棗粗多糖得率的影響圖

表7 提取時間對大棗粗多糖得率的影響數據分析表（n=3）

表8 正交試驗因素水平表

2.4 正交試驗優化大棗多糖提取工藝結果

在單因素實驗基礎上，選取三個考察因素即提取溫度、提取時間、料液比，考察不同條件對提取大棗粗多糖得率的影響，為正交試驗提供合理提取條件，再在一定料液比（g∶mL）、提取時間（h）、提取溫度（℃）下，通過水體醇沉法提取大棗粗多糖，以大棗粗多糖得率為判別指標，設計出正交試驗，優化大棗多糖最佳提取工藝，詳見表8-10。

從表9可以看出，將三種因素在正交試驗表格中的極差（R）進行比較，得到RC＞RA＞RB；影響大棗粗多糖得率的主要因素首先是提取溫度，其次是料液比，最后是提取時間；借助表10，確定大棗多糖最佳提取參數為A3、B3、C3，即提取時間2 h、料液比1∶24、提取溫度88 ℃。

表9 正交試驗因素水平表

表10 正交試驗方差分析表

2.5 驗證結果

在正交試驗優化的最佳提取工藝基礎上，取脫脂后大棗粉15 g，以1:24的料液比、4 h的提取時間、88 ℃提取溫度，用水提醇沉法分別進行3次實驗。最終大棗粗多糖得率為9.60%、9.59%、9.51%，平均得率為9.57%，3次結果相差不大，表明此工藝條件是合理的。

2.6 大棗多糖含量測定

用脫脂后的大棗粉15 g進行水提醇沉，以最佳工藝進行提取，得到1.7 g大棗粗多糖。精確稱取約0.02 g粗多糖，按照1.2.6方法處理，進行含量測定，在紫外分光光度計下490 nm處測得的吸光度A為0.374，將其代入線性回歸方程Y=0.006 6X+0.229 5，得到大棗粗多糖濃度為21.89 μg/mL,再代入公式（3）得大棗粗多糖含量為116.47 mg/g。

2.7 抗氧化活性測定

以DPPH法，抗壞血酸（Vc）作為對陽性照，結果顯示，大棗多糖的濃度與DPPH的清除率有一定的相關性，大棗多糖的濃度在0.2~1.0 mg/mL之間，清除率隨著濃度的升高而增大，且呈現劑量-反應關系，大棗多糖濃度為1.0 mg/mL，大棗多糖的清除效率可達90%以上，說明大棗多糖的抗氧化能力很強（如圖6所示）。

圖6 大棗多糖對DPPH自由基清除活性圖

3 討論

（1）脫脂方法選擇：在實驗當中，分別采用95%乙醇和石油醚兩種脫脂溶劑在不同脫脂條件下進行脫脂，最終選擇95%乙醇進行脫脂。（2）提取工藝篩選：在預實驗當中，統一條件下，對水提和超聲波輔助提取進行比較，其結果表明水提方法好，且粗多糖得率最高。（3）提取工藝優化：在提取工藝的優化實驗中，采用料液比、溫度、時間三個參數，對大棗多糖提取工藝進行了優化，采用單因素和正交實驗法，得出最佳提取工藝參數：料液比為1∶24、提取溫度為88 ℃、提取時間為4 h。魏然[10]通過優化得到的熱水提取大棗多糖條件，影響多糖提取率的順序是溫度＞時間＞料液比，最優條件為：液料比1∶20、提取溫度90 ℃、提取時間5.3 h，得率為5.27%。（4）抗氧化活性：本文經過單因素和正交試驗對大棗多糖提取工藝進行了優化，緊接著進行了抗氧化活性研究，得出大棗多糖與活性大小成正比，與李雪華等[11]研究結果一致，都說明了大棗多糖具有較強的抗氧化活性。

4 結語

大棗多糖最佳提取條件為：提取時間4 h，提取溫度88 ℃，料液比1∶24，所測的大棗粗多糖含量為116.47 mg/g。本研究結果表明大棗多糖溶液具有清除自由基的能力，證實了大棗多糖是一種很好的體外抗氧化活性成分。