高效液相色譜法測定滇橄欖粉中槲皮素的含量

◎ 李惠娟，楊欣怡，王怡瑾，張 瑜，季樹聰，孫嶺明

（1.云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，云南 昆明 650500；2.云南白藥集團(tuán)文山七花有限責(zé)任公司，云南 文山 663099）

滇橄欖，又名云南滇橄欖，首載于《唐本草》，是大戟科落葉灌木或喬木植物的果實(shí)。該植物春季開花，花小，單生黃色，雌雄同株，其果實(shí)肉質(zhì)，扁球形，熟時呈紅色。滇橄欖主要分布于亞洲熱帶地區(qū)，是一種重要的藥食兩用植物資源。滇橄欖的果實(shí)富含多種營養(yǎng)成分，如脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)等，具有多種保健功效，如降血脂、抗氧化、抗炎、抗菌等。因此，滇橄欖被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品等領(lǐng)域[1]。滇橄欖果實(shí)中含有黃酮類化合物，1994 年，日本學(xué)者用甲醇和水提取滇橄欖果實(shí)，從中得到槲皮素，山奈酚-3-O-葡萄糖甙(Kaempferol-3-0-glucoside)、槲皮素-3-O-葡萄糖甙 (Quercetin-3-0-glucoside)、無色飛燕草素leuco delphinidin。滇橄欖果汁風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，是一種非常有價值的水果，含有大量維生素C。由于黃酮和單寧類物質(zhì)的作用，滇橄欖經(jīng)加工后，其維生素C的保存率可以高達(dá)72%[2]。這些特點(diǎn)使滇橄欖成為一種非常有價值的水果，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品等領(lǐng)域。此外，滇橄欖還具有化痰止咳的功效、健胃消食，清熱生津，保肝解毒等功效，主治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉痛、白喉、煩熱口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血壓病、肥胖癥、高脂血癥、熱性水腫和尿頻等，具有清熱利咽、潤肺化痰、生津止渴之功效。此外，現(xiàn)代研究表明，滇橄欖具有抗氧化、除自由基、抗腫瘤、防衰老等[3]。

滇橄欖粉由滇橄欖鮮果壓榨取汁，加入一定量糊精，噴霧干燥而成，該制備方法已由麗江格林斯通食品有限公司申請獲得專利，但該法所得產(chǎn)品（滇橄欖粉）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，目前尚無含量測定項(xiàng)目。為了更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，本文對滇橄欖粉中的槲皮素含量進(jìn)行了測定，并進(jìn)行了相關(guān)方法考察。

以滇橄欖為原料的食品較多，主要有滇橄欖茶飲料、滇橄欖含片、滇橄欖果泥、滇橄欖果珍、滇橄欖果酒、滇橄欖保健茶、滇橄欖潤喉糖等。其中以飲料居多，但是由于口感的原因，大多數(shù)人難以接受，故市場銷售并不太好。當(dāng)然，滇橄欖還可用于提取橄欖油。為更好地利用滇橄欖資源、開發(fā)口感較好食品，本文擬將其制成復(fù)方滇橄欖含片。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT25S型電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）；高效液相色譜儀（Aglient 1100，四元泵，DAD檢測器）；Agilent ZORBAX SB-C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，等。

1.2 試藥

滇橄欖粉末，由麗江格林斯通食品有限公司提供；甲醇為液相使用色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照品

含量測定對照品：槲皮素（對照品批號：100081-201610，中國食品藥品生物制品檢定研究院提供。）

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.05%磷酸溶液（45:55），八烷基鍵合硅膠為固定相 (4.6 mm×250 mm，5μm)，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為370 nm；理論板數(shù)≥4 000。

2.2 對照品溶液制備

槲皮素對照品：精密稱取對照品適量，加乙醇使其溶解，制備成0.012 mg/ml對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

供試品制備：精密稱定滇橄欖粉末約5.0 g，置100 ml錐形瓶中，精密加入2%鹽酸-乙醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，補(bǔ)重用2%鹽酸-乙醇溶液，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，用0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 檢測波長的選擇

通過槲皮素對照品的乙醇溶液光譜圖（見圖1），可以看出對照品在250 nm、370 nm處有較大吸收峰，故本次試驗(yàn)測定波長選取370 nm。

圖1 槲皮素對照品溶液光譜圖

圖2 槲皮素對照品色譜圖

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用甲醇-0.05%磷酸溶液（45:55）為流動相，用辛烷基鍵合硅膠為填充劑 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為370 nm；理論板數(shù)≥4 000。另取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。測定結(jié)果見表1，色譜圖見2和圖3。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果表

圖3 滇橄欖粉供試品色譜圖

結(jié)果表明：在上述色譜條件下，槲皮素峰的對稱因子、分離度、理論塔板數(shù)均符合中國藥典要求，可用于該物質(zhì)的含量測定。

2.6 線性與范圍

精密吸取槲皮素對照品溶液(0.01 mg/m1)1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，分別注入高效液相色譜儀，參照上述色譜條件測定峰面積，詳細(xì)結(jié)果見表2。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4），并計算回歸方程。結(jié)果槲皮素對照品的回歸方程為A= 6 585.2C+4.668( r=0.999 9)，槲皮素在0.012 μg~0.24 μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

表2 槲皮素對照品線性關(guān)系與范圍的考察表

圖4 槲皮素線性關(guān)系與范圍考察圖

2.7 供試品溶液提取水解條件考察

2.7.1 供試品溶液制備提取方法選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，擬訂了兩種方法。

方法一: 取滇橄欖粉末約5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇250 mL，回流1.5 h，回收甲醇至干，殘?jiān)倬芗尤?%鹽酸-甲醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，補(bǔ)重用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，過0.45 μm濾膜濾過，即得。

方法二：取滇橄欖粉末約5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入5%鹽酸-甲醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定重量，補(bǔ)重用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm濾膜濾過，即得。

按2.4項(xiàng)下色譜條件測定槲皮素含量，結(jié)果見表3。

表3 不同提取方法的比較表

結(jié)果表明，方法二處理的樣品槲皮素含量更高，因此選用了方法二進(jìn)行槲皮素的提取。

2.7.2 供試品溶液制備提取溶劑選擇

精密稱定滇橄欖粉末3份，每份約5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，每份樣品精密加入5%鹽酸-甲醇溶液、5%鹽酸-乙醇溶液、5%鹽酸-50%乙醇溶液50 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定槲皮素含量，結(jié)果見表4。

表4 不同提取溶劑的比較表

結(jié)果表明，以乙醇含量最高，因此，選用乙醇作為提取溶劑。

2.7.3 供試品溶液制備水解催化劑種類選擇

精密稱定滇橄欖粉末3份，每份約5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，每份樣品分別精密加入5%鹽酸-乙醇溶液、2%硫酸-乙醇溶液、1%氫氧化鈉-乙醇溶液50 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定槲皮素含量，結(jié)果見表5。

表5 不同水解催化劑的比較表

結(jié)果表明，水解催化劑以鹽酸為佳。

2.7.4 供試品溶液制備鹽酸濃度選擇

精密稱定滇橄欖粉末3份，每份約5.0 g，置100 mL錐形瓶中，每份樣品分別精密加入溶劑2%鹽酸-乙醇溶液、5%鹽酸-乙醇溶液、8%鹽酸-乙醇溶液50 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件，測定槲皮素含量，結(jié)果見表6。

表6 不同水解鹽酸濃度的比較表

結(jié)果表明，三者含量接近，因此，選用的鹽酸濃度為2%。

2.7.5 供試品溶液制備提取水解時間選擇

精密稱定滇橄欖粉末3份，每份約5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，每份樣品分別精密加入2%鹽酸-乙醇溶液50 mL，稱定重量，分別加熱回流0.5 h、1 h、1.5 h，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定槲皮素含量，結(jié)果見表7。

表7 不同提取時間的比較表

結(jié)果表明，水解時間以1.0 h為佳。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取滇橄欖粉末，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液于0 h、2h、4 h、6 h、 8 h、10 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值。測得結(jié)果如表8。結(jié)果表明，溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表8 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

2.9 重復(fù)性測試試驗(yàn)

精密稱定同一批滇橄欖粉末6份，分別按含量測定方法項(xiàng)下列舉的方法測定，計算出槲皮素含量，結(jié)果詳見表9。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，滇橄欖粉末樣品平均含量0.192 mg/g，RSD值＜2%，證明考察方法重復(fù)性良好。

表9 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取已知含量的滇橄欖粉末6份（槲皮素含量為0.192 mg/g），每份約2.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入槲皮素對照品溶液（槲皮素5.0 mg→100 mL乙醇溶液）10 mL，再精密補(bǔ)加2%鹽酸-乙醇溶液40 mL，每份均按2.3項(xiàng)下方法供試品溶液制備方法制備成供試液，取10 μL注入液相色譜儀測定含量，計算回收率，結(jié)果見表10。

表10 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6份樣品的RSD值為0.89%＜2.0%，說明本實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。

3 討論

考慮到提取的簡化和溶劑的節(jié)約問題，故在試驗(yàn)中采用了2.6.1中方法二的提取方法進(jìn)行槲皮素的提取，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，方法二中方案是可行的。

本實(shí)驗(yàn)中用到的滇橄欖粉是由麗江格林斯通食品有限公司提供，其制作方法由該公司申請過專利，但原標(biāo)準(zhǔn)中未對有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，通過本方法可以對滇橄欖粉的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

在用槲皮素提取的過程中，用到了甲醇、乙醇為溶劑對滇橄欖粉進(jìn)行提取，結(jié)果表明，乙醇的提取效果要比甲醇好，其原因可能是槲皮素在乙醇中有較大的溶解度，而甲醇對其的溶解性沒有乙醇好。試驗(yàn)中，對水解酸堿度進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在堿性條件下，黃酮類化合物只有很小的一部分水解生成槲皮素，可能是在堿性條件下黃酮類化合物發(fā)生了開環(huán)，生成了其他化合物，或是生成了鹽類化合物。通過實(shí)驗(yàn)得出，滇橄欖粉中槲皮素提取的最優(yōu)方法是2%鹽酸-乙醇溶液進(jìn)行提取水解，水解時間為1 h。用該方法進(jìn)行提取的槲皮素提取率較高、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性較高，并能保證在一定的誤差范圍內(nèi)，有效控制滇橄欖粉的質(zhì)量。