DDAH1 基因836A/T 多態性與云南地區漢族2 型糖尿病腎臟疾病的相關性分析

譚 洪 ，殷和佳 ，李 妍 ，胡 琴 ，李 斕 ，任遵丹 ，石 柔

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院內分泌二科，云南 昆明 650032;2）昆明醫科大學第一臨床醫學院，云南 昆明 650500）

據國際糖尿病聯盟估計，2021 年全球有5.37億人患有糖尿病（diabetes mellitus，DM），預計到2045 年將增加到7.84 億[1]。DM 會導致多種慢性并發癥，其中糖尿病腎臟疾病（diabetic kidney disease，DKD）是最嚴重的并發癥之一，其發病率約20%～40%[2]。氧化應激是內皮功能障礙的重要發病機制之一，是DKD 的標志性特征[3]。在DKD 患者中發現到與氧化應激密切相關的高水平的非對稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine ADMA）[4]。二甲基精氨酸二甲胺水解酶1（dimethyl arginine dimethylamine hydrolase 1 DDAH1）是ADMA 代謝的關鍵酶，其基因多態性與ADMA水平及氧化應激相關[5]，但與DKD 的關系尚不明確。本研究的目的為探討DDAH1 基因836A/T 多態性與云南地區漢族2 型糖尿病腎臟疾病的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

均符合1999 T2DM 診斷標準[6]。納入標準：民族為漢族，籍貫為云南省，在云南居住10 a 以上，相互間無親緣關系。排除標準：其它疾病引起的蛋白尿及腎功能不全、合并嚴重肝功能不全、糖尿病酮癥、感染性疾病、妊娠者。選取2017年5 月至2019 年2 月期間到昆明醫科大學第一附屬醫院就診的T2DM 患者共660 例，男334 例，女326 例，平均年齡（55.87±11.45）歲。根據隨機尿尿白蛋白/肌酐比值（UACR）分為單純2 型糖尿病組（DN0 組，UACR ≤ 30 μg/mg），合并早期腎病組（DN1 組，UACR 30～299 μg/mg），合并臨床期腎病組（DN2 組UACR ≥ 300 μg/mg），合并腎病組（DN1+DN2 組）。同時納入同期昆明醫科大學第一附屬醫院體檢中心的健康人群（NC 組），共304 例，男154 例，女150 例，年齡（54.62±10.58）歲。無糖尿病、高血壓家族史，且經糖耐量試驗排外糖尿病。所有研究對象均為云南區域無親緣關系的漢族。研究方案經昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準，所有樣本采集均需知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DDAH1基因836A/T 多態性分析方法研究對象外周靜脈血中DNA 的抽提采用全血基因DNA 提取試劑盒提取。之后以特定的引物（通用生物系統有限公司合成）進行聚合酶鏈反應（PCR）[7]，引物序列見表1。將純化后的PCR 產物在3730xl 型測序儀上進行DNA 測序，得到3種基因型（圖1～圖3）。

圖1 DDAH1 基因836AA 基因型對應的測序圖Fig.1 DDAH1 gene 836AA genotype sequencing

圖2 DDAH1 基因836TT 基因型對應的測序圖Fig.2 DDAH1 gene 836TT genotype sequencing

圖3 DDAH1 基因836AT 基因型對應的測序圖Fig.3 DDAH1 gene 836AT genotype sequencing

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.2 臨床及生化指標檢測檢測血肌酐、尿酸、血脂、UACR（均采用貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀），用高效液相法測定糖化血紅蛋白（HBA1C）含量，用雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國 RD）測定血漿ADMA 水平。測量血壓。

1.3 統計學處理

數據分析選擇SPSS19.0 軟件。用哈迪-溫伯格遺傳平衡定律檢驗樣本的人群代表性。計量資料以表示，各組間采用單因素方差分析進行比較。計數資料以n（%）描述，各組間等位基因和基因型頻率的差異采用χ2檢驗分析。采用Logistic 回歸分析T2DM 發生DKD 的危險因素。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組間臨床資料比較

病程、SBP、LDL-C、ADMA 在DN1+DN2 組高于DN0 組。為排除混雜因素對結果的干擾，進一步行協方差分析，兩組間病程、ADMA 差異仍有統計學意義（P＜ 0.05）。病程、SBP、血肌酐、尿酸在DN2 組高于DN1 組、為排除混雜因素對結果的干擾，進一步行協方差分析，病程、SBP在兩組間的差異仍有統計學意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 各組間臨床資料比較（）Tab.2 Comparison of clinical data of each group（）

表2 各組間臨床資料比較（）Tab.2 Comparison of clinical data of each group（）

與NC組比較，* P ＜ 0.05；與DN0組比較，△P ＜ 0.05；與DN1組比較，#P ＜ 0.05；協方差分析，▲P ＜ 0.05。

2.2 各組間DDAH1 基因836A/T 多態性比較

AA 基因型頻率：DN1+DN2 組高于DN0 組，差異顯著（P＜ 0.05）。A 等位基因頻率：DN1 +DN2 組高于DN0 組，差異顯著（P＜ 0.05）。但AA、AT+TT 基因型頻率、A 等位基因頻率在DN1 和DN2 組間無顯著性差異（P＞ 0.05），見表3。

表3 各組間基因型頻率和等位基因頻率[n（%）]（1）Tab.3 The genotype and allele frequencies in each group [n（%）]（1）

2.3 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較

在T2DM 患者中，DDAH1 基因836AA 基因型攜帶者較AT+TT 基因型個體具有更高的ADMA水平（P＜ 0.05），見表4。

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（2）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（2）

表4 T2DM 患者中不同基因型間臨床資料比較（ ）（1）Tab.4 Comparison of clinical data of DDAH1 genotype of T2DM patients（）（1）

2組間比較，*P ＜ 0.05。

2.4 T2DM 患者發生DKD 的危險因素分析

以2 型糖尿病患者發生DKD 與否（發生=1，不發生=0）作為因變量，將單因素分析中有統計學意義的變量（基因型、收縮壓、血肌酐、尿酸、甘油三酯、低密度脂蛋白、糖化血紅蛋白、ADMA 水平、病程）為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結果顯示，在2 型糖尿病患者中病程、ADMA、DDAH1 基因836 位點AA 基因型是DKD發生的危險因素（表5）。以2 型糖尿病患者DKD發展與否（發展=1，不發展=0）作為因變量，選擇上述各項指標作為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結果顯示，在2 型糖尿病患者中病程、SBP 是DKD 發展的危險因素，DDAH1 基因836位點基因多態性不是DKD 發展的危險因素（表6）。

表5 T2DM-DKD 發生的危險因素的Logistic 分析Tab.5 Logistic regression analysis of T2DM-DKD occurence

表6 T2DM-DKD 發展的危險因素的Logistic 分析Tab.6 Logistic regression analysis of T2DM-DKD development

3 討論

DKD 是T2DM 微血管病變的致命表現之一，同時也是全球范圍內導致終末期腎臟疾病發生及死亡的主要原因[8]。以一氧化氮（NO）生物利用度降低和氧化應激升高為特征的內皮功能障礙是糖尿病和DKD 的顯著特征[9]。ADMA 是一種內源性一氧化氮合酶抑制劑，影響NO 的水平，參與氧化應激及內皮功能障礙。近期研究發現，糖尿病前期和T2DM 患者的ADMA 濃度均顯著升高[10]。蛋白尿是DKD 最重要的臨床標記物之一，動物實驗和臨床研究均表明，ADMA 升高與重度蛋白尿相關[11]。與此同時在動物模型和糖尿病微血管病變（如視網膜病變、腎病和神經病變）患者中也檢測到ADMA 升高[12]。一項meta 分析也提示，DM合并蛋白尿患者ADMA 明顯升高，ADMA 可能在包括DKD 在內的糖尿病微血管并發癥的病理生理學過程中發揮重要作用[13]。來自印度的一項臨床研究結果表明，ADMA 有可能成為DKD 的預測因子[14]。本研究發現在云南地區漢族2 型糖尿病患者中，合并DKD 患者較未合并DKD 患者ADMA水平升高，但在DKD 亞組（DN1、DN2）間ADMA濃度無差異。行相關危險因素分析后，提示ADMA 是DKD 發生的危險因素。提示ADMA 作為氧化應激的重要刺激因子，對DKD 的發生可能起重要作用，但對DKD 病情進展可能不是主要的促進因素。

DDAH 通過降解ADMA 來維持NO 的生物利用度。DDAH 的兩種亞型（DDAH-1 和DDAH-2）由兩種不同的基因編碼，具有不同的組織分布。盡管2 者都在腎臟中表達，主要在腎小球內皮細胞、致密斑和小管細胞中[15]，但DDAH-1 是降解ADMA 的關鍵同工酶[3]。在健康和糖尿病小鼠中發現缺乏DDAH1 導致血漿ADMA 水平顯著升高[16]。DDAH1 缺乏可促進腎近端小管上皮細胞向間充質細胞轉變，并在糖尿病腎臟中引起纖維化和氧化應激[17]。而纖維化和氧化應激都是DKD 的顯著病理生理特征。Michael DW 等[3]報道，DKD 與腎臟中ADMA 增加和DDAH 活性及DDAH1 表達降低相關，使用腺病毒載體在腎內過表達DDAH1 可顯著減少腎損傷。上述研究結果提示，DDAH1 可能通過對ADMA 的調節影響DKD 的發生。DDAH1 基因序列變異與血清ADMA濃度密切相關[18-19]。國外學者研究了編碼ADMA代謝相關酶DDAH1 的基因多態性，發現DDAH1 rs233112，rs669173、rs7521189、rs2474123 和rs13373844 幾個單核苷酸多態性與ADMA 水平密切相關[18,20]。還有一些報道提示DDAH1 基因變異與糖尿病及其并發癥有關。例如：DDAH1 啟動子-396_-395插入等位基因（GCGT）增加男性T2DM 患病風險[21]。DDAH1 rs233109 CC 純合子的患者比攜帶TT 純合子的患者更容易發生糖尿病大血管病變[22]。但目前有關DDAH1 基因多態性與DKD 關系的研究報道罕見。本研究通過對云南地區漢族T2DM 患者DDAH1 基因836 多態性研究，發現攜帶AA 基因型的患者更容易發生DKD，并且該基因型攜帶者ADMA 水平升高。但在DKD 亞組（DN1、DN2）間沒有發現該基因位點的遺傳差異。相關危險因素分析顯示DDAH1 基因836 位點AA 基因型是T2DM 發生DKD 的危險因素。

綜上所述，在云南地區漢族2 型糖尿病患者中，ADMA 水平升高可能增加DKD 發生的風險。DDAH1 基因836 多態性與DKD 的發生相關，AA基因型可能通過調控DDAH1 的表達和活性，增加ADMA 的濃度，從而促進DKD 的發生。然而在DKD 患者中ADMA 升高的確切機制尚不完全清楚。未來應對ADMA 進行連續測定的前瞻性研究以進一步證實ADMA 作為DKD 的生物標志物及致病因素的因果關系。另一方面，本研究樣本量有限，而且影響DDHA1 基因表達的位點不止1個，當其它位點變異時可能增強或減弱836 位點變異的作用。因此，今后還應進一步增加樣本量，同時聯合DDHA1 基因其他位點進行系統研究，并結合動物模型及體外實驗輔以功能實驗，進一步揭示DDHA1 基因遺傳多態性與DKD 的內在關系。