莪術醇對胃癌AGS細胞增殖、凋亡的影響及機制研究

周桂香 鄧帥 班江文 陳雯雯 譚寶

胃癌已經成為世界范圍內的常見惡性腫瘤之一,其高發病率與死亡率不僅嚴重危害國民的生命健康,并且在很大程度上也給國家及社會的進步和發展帶來沉重的疾病負擔[1]。近年來,隨著中草藥不斷進入人們的視野,越來越多的中草藥及中藥單體被發現在抗腫瘤中具有獨特的作用和顯著的優勢,在抑制腫瘤增長的同時可以提高機體的免疫力,還可以增敏減毒,與化療藥配合使用起到協同增效的作用[2]。

莪術,又稱黑心姜、烏姜、姜七,為姜科姜黃屬植物,功擅破血行氣,消積止痛[3],主開胃消食,破積聚,行血瘀,除腹痛。現代藥理研究發現,莪術揮發油具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗腫瘤的功效[4],課題組前期實驗已經證實莪術揮發油能夠通過誘導細胞凋亡和周期阻滯來發揮抗腫瘤的功效[4]。因此,本實驗以莪術揮發油中所占含量比最多的單體成分莪術醇為實驗對象,選取磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路為研究切入點,通過探討莪術醇作用于胃癌AGS細胞后對該信號通路的影響,以期進一步闡明莪術醇抗腫瘤作用可能的機制,為今后的臨床疾病治療及新藥開發提供相關實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

胃腺癌AGS細胞株,購于上海生命科學院細胞庫。

1.2 細胞培養

將復蘇后的胃癌AGS細胞在完全培養基中(含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗)培養,放入5% CO2、37℃的恒溫飽和濕度的培養箱,觀察細胞生長情況,根據生長狀態進行換液,細胞約鋪滿培養瓶底85%左右時,用0.25%的胰酶進行消化傳代。

1.3 主要藥物與試劑

莪術醇購于成都曼斯特生物科技有限公司(批號:MUST-20060802,質量標準為99.76%),將其溶于二甲基亞砜中,然后用全培進行稀釋,使稀釋后的二甲基亞砜終濃度≤5‰;順鉑注射液(江蘇豪森藥業集團有限公司,批號:601210605,規格:6 mL∶30 mg);胎牛血清(杭州四季青有限公司,批號:21090706);DMEM培養基(批號:MA0212)、0.25%胰酶(批號:MA0232)、PBS溶液(批號:MA0015)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號:Jan-18G)均購于大連美侖生物技術有限公司;細胞周期試劑盒(批號:A10734)購于聯科生物公司;CCK-8檢測試劑盒(批號:SC119-02)購于大連美侖生物技術有限公司;B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(批號:3560006120)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)抗體(批號:3560138106)、β-actin抗體(批號:2021040708)購于武漢ABclonal公司;PI3K抗體(批號:ab151549)、p-Akt抗體(批號:AF0908)、p-mTOR抗體(批號:CST-5536)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗體(批號:GB11767c)均購于武漢塞維爾生物科技有限公司;增強型RIPA裂解液(批號:16128C02)、BCA蛋白濃度測定試劑(批號:16H10A46)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號:16J20B12)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號:16J27C38)均購于博士德生物有限公司。

1.4 實驗儀器

超凈工作臺、細胞培養箱和-80℃低溫冰箱(美國Thermo公司);酶標儀(美國Molecular Devices公司);倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(ZEISS公司);低速離心機(中科中佳有限公司);流式細胞儀(Beckman Coulter公司);WB顯影儀(Protein Simple公司);水平搖床、電泳儀(北京六一生物科技有限公司);電泳槽、轉膜儀(美國BIO-RAD公司);各種量程手動移液器(大龍興創實驗儀器股份公司)。

1.5 實驗方法與指標檢測

1.5.1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 將用0.25%胰酶消化后的胃癌AGS細胞調整至濃度約為5×104個/mL的細胞懸液,選取96孔板進行種板。設空白對照組、莪術醇低濃度組、莪術醇中濃度組、莪術醇高濃度組和陽性對照組,每組設6個復孔,每孔100 μL細胞懸液。

種板結束后將96孔板放入培養箱中進行培養,培養至細胞貼壁后將預先用全培稀釋好的莪術醇依次加入。莪術醇低、中、高濃度組濃度分別為12.5、25、50 μg/mL;空白對照組加入稀釋濃度為5‰二甲基亞砜的完全培養基;陽性對照組加入5 μg/mL的順鉑,將96孔板放回培養箱繼續培養24、48小時。

將96孔板從培養箱中取出,棄去孔內的舊含藥培養基,加入CCK-8混合工作液110 μL,孵育1小時左右時,在酶標儀450 nm波長條件下測定各個孔的吸光度(OD值),每組OD值舍棄最大和最小值,選取4個復孔,根據OD值計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)×100%。

1.5.2 細胞凋亡檢測 胃癌AGS細胞以1×105個/mL接種于6孔板內,設空白對照組、莪術醇低、中、高濃度組,每組選取3個復孔,每孔接種2 mL細胞懸液,過夜細胞貼壁后將舊培養基棄掉。莪術醇低、中、高濃度組依次加入濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術醇進行干預,空白對照組加入新鮮全培作對照。繼續培養24、48小時,藥物干預結束后分組將孔板內的細胞上清液收集,再用不含EDTA的胰酶消化細胞,全培終止消化后按順序依次移入事先裝有上清液的離心管中,上機離心后(1 000r/min,離心力179 g,離心5分鐘)棄掉上清液,PBS(-20℃預冷)輕柔吹打洗滌兩次,離心棄去PBS,用稀釋后的1×Binding buffer工作液重懸細胞,濃度約為1×106個/mL。將重懸后的細胞移至流式管中,每管約100 μL,然后加入雙染試劑(Annexin V-FITC和PI)各5 μL和10 μL,充分混勻后室溫下避光孵育20分鐘左右,然后每管再次加入400-600 μL的1×Binding buffer工作液,混勻后上流式細胞儀檢測(一般要求在1小時內上機為佳)。實驗重復3次。

1.5.3 細胞周期檢測 將離心后的胃癌AGS細胞沉淀重懸為1×105個/mL的重懸液接種于6孔板內,設空白對照組、莪術醇低、中、高濃度組,每組設3個復孔,每個復孔2 mL細胞重懸液,待細胞在培養箱中貼壁后加藥,莪術醇低、中、高濃度組依次加入濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術醇進行干預,空白對照組更換為不含藥物的全培。加藥后允許細胞繼續生長24、48小時,干預時間完成后用0.25%的胰酶進行消化,全培終止后輕輕吹打培養板底部的細胞,然后用移液器移入離心管上機離心(1 000r/min,離心力179 g,離心5分鐘)。棄掉上清液,加入室溫下PBS(約1 mL)重懸,然后將混懸液一邊高速攪拌一邊緩緩加入約3 mL的無水乙醇中(-20℃預冷),-20℃固定過夜保存。上機檢測時,將在-20℃固定的細胞先離心棄掉乙醇固定液,然后加入PBS水化細胞(室溫條件下3-5 mL),室溫下水化5分鐘左右,然后移至流式管中,再次離心棄上清。加入1 mL的DNA staining solution試劑進行細胞染色,渦旋機混勻后室溫下避光孵育約30分鐘,上機檢測細胞的周期分布。實驗重復3次。

1.5.4 Wound healing檢測胃癌AGS細胞的遷移、修復能力 將胃癌AGS細胞重懸為約1×105個/mL的濃度進行種板,6孔板每孔接種1.5 mL懸液,設空白對照組、莪術醇低、中、高濃度組,每組3個復孔。鋪板結束后在培養箱中培養,觀察細胞生長情況,待細胞在6孔板底部形成單細胞層時,用10 μL的移液器槍頭尖端在各個孔底垂直畫一條直線,操作過程要保證槍頭垂直,用無菌PBS將脫落的細胞清洗三次,然后將空白組加入無血清的培養基,莪術醇低、中、高濃度組分別加入用無血清培養基稀釋的濃度為12.5、25、50 μg/mL的莪術醇;藥物干預48小時后,每組分別在藥物干預前、后選擇三個不同的視野進行拍照,用Image J軟件分析干預前后的劃痕面積,根據劃痕面積差異計算劃痕愈合率。

傷口劃痕愈合率=[(劃痕面積0小時-劃痕面積48小時)/劃痕面積0小時]×100%

1.5.5 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達 將生長狀態良好的胃癌AGS細胞消化離心后,以1×105個/mL濃度于6孔板中種板,每孔約2 mL懸液。設空白對照組、莪術醇低、中、高濃度組和陽性對照組,每組設3個復孔。細胞貼壁后棄掉孔內舊培養基,空白對照組更換新鮮全培,莪術醇低、中、高濃度組加入濃度分別為12.5、25、50 μg/mL的莪術醇干預,陽性對照組加入5 μg/mL的順鉑。在培養箱中培養48小時后去除孔板內原有培養基,用PBS清洗各孔,然后每孔加入200 μLRIPA裂解液,晃動6孔板,使裂解液與細胞完全接觸,孔板在冰上裂解10分鐘左右,將經過裂解的細胞移入EP管中,繼續在冰上進行裂解,然后渦旋震蕩3次,每次間隔10分鐘,結束后4℃低溫離心機離心(12 000 r/min,離心15分鐘),提取總蛋白。然后用BCA試劑盒進行樣本總蛋白濃度定量,將EP管中取樣定量后剩余的蛋白高溫變性,-20℃冰箱保存。每組等量的蛋白質(每孔15 μg蛋白)進行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜、5%脫脂牛奶4℃冰箱封閉過夜,TBST洗膜后,加一抗PI3K、p-Akt、p-mTOR、Caspase-3、Bcl-2、Bax及β-actin(按比例進行稀釋),4℃冰箱孵育過夜后棄去一抗,加二抗(羊抗兔IgG-HRP,1∶5 000),室溫下孵育2小時,結束后再次用TBST洗膜3次,每次大約10分鐘,滴加ECL發光液,凝膠成像系統進行顯影、拍照。選取β-actin為實驗的內參蛋白,用Image J軟件進行目標蛋白條帶灰度值的統計分析,通過目標蛋白的條帶灰度值表達差異來計算各個蛋白的相對表達量。

1.6 數據處理

2 結果

2.1 莪術醇對胃癌AGS細胞生長活力的影響

用不同濃度的莪術醇干預胃癌AGS細胞24小時后,胃癌AGS細胞活力從89.32%下降到51.21%;干預48小時后,胃癌AGS細胞活力從65.03%下降到19.14%,經計算得出莪術醇干預24小時和48小時的半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)值分別為50.04 μg/mL和19.91 μg/mL。因此,莪術醇濃度不同,干預時間不同,其增殖抑制率有明顯差別。根據實驗結果可知,莪術醇對胃癌AGS細胞增殖抑制作用呈現出良好的濃度-時間依賴性。見表1,圖1。

圖1 莪術醇干預胃癌AGS細胞24小時和48小時的IC50值

表1 莪術醇對AGS細胞活力的影響

2.2 莪術醇對胃癌AGS細胞凋亡的影響

莪術醇干預胃癌AGS細胞24、48小時后,采用Annexin V-FITC和PI雙染法將凋亡細胞和正常細胞區分,上機用流式細胞儀檢測不同濃度和不同干預時間的細胞凋亡率。結果顯示,莪術醇干預胃癌AGS細胞24小時后,細胞凋亡率從22.7%上升到52.43%;干預48小時后,凋亡率從37.17%上升到64.37%。不同濃度的莪術醇干預胃癌AGS細胞后,隨著時間的延長凋亡率逐漸增加,呈現出良好的時效-量效關系。見表2、圖2、表3、圖3。

注A 空白對照組;B 莪術醇低濃度組;C 莪術醇中濃度組;D 莪術醇高濃度組。圖2 莪術醇干預24小時對胃癌AGS細胞凋亡的影響

注A 空白對照組;B 莪術醇低濃度組;C 莪術醇中濃度組;D 莪術醇高濃度組。圖3 莪術醇干預48小時對胃癌AGS細胞凋亡的影響

表2 莪術醇干預24小時對胃癌AGS細胞凋亡的影響

表3 莪術醇干預48小時對胃癌AGS細胞凋亡的影響

2.3 莪術醇對AGS細胞周期的影響

流式細胞儀檢測胃癌AGS周期分布結果可知,莪術醇干預胃癌AGS細胞24小時后,出現細胞的G2/M期周期阻滯,干預后處于G2/M期的細胞由3.95%上升到17.03%,并且藥物濃度越高細胞G2/M期周期阻滯比率越高;莪術醇干預48小時后,細胞出現明顯的G0/G1期阻滯,細胞所占比由52.34%增加到72.04%,周期阻滯作用呈現出藥物濃度依賴性。由此可知,在莪術醇濃度相同的情況下,可能由于干預時間的差異,使得AGS細胞的周期阻滯作用出現差異。見表4、表5,圖4、圖5。

注A 空白對照組;B 莪術醇低濃度組;C 莪術醇中濃度組;D 莪術醇高濃度組。圖4 莪術醇干預24小時對胃癌AGS細胞周期的影響

注A 空白對照組;B 莪術醇低濃度組;C 莪術醇中濃度組;D 莪術醇高濃度組。圖5 莪術醇干預48小時對胃癌AGS細胞周期的影響

表4 莪術醇干預24小時對胃癌AGS細胞周期分布的影響

表5 莪術醇干預48小時對胃癌AGS細胞周期分布的影響

2.4 莪術醇對AGS細胞遷移和修復能力的影響

與空白對照組相比,不同濃度的莪術醇干預AGS細胞48小時后各組的傷口愈合率呈明顯下降趨勢,傷口愈合率從對照組的78.05%下降到17.51%。同時,隨著莪術醇濃度的梯度遞增,傷口的愈合率明顯下降,表明莪術醇能夠抑制胃癌AGS細胞的遷移,降低傷口的修復能力。見圖6,表6。

圖6 各組胃癌AGS細胞劃痕實驗愈合情況

表6 莪術醇對胃癌AGS細胞劃痕愈合率的影響

2.5 莪術醇對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

胃癌AGS細胞經不同濃度的莪術醇及陽性藥順鉑干預48小時后,與空白對照組相比,各給藥組PI3K、p-Akt、p-mTOR表達均顯著下調(P<0.05);與莪術醇高濃度組相比,陽性對照組的PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05),說明莪術醇的干預可使PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達下降,但高濃度莪術醇和順鉑抑制效果相差不大。

與空白對照組相比,各藥物組Bax蛋白表達水平呈上調趨勢,Bcl-2蛋白表達水平下調,Caspase-3蛋白表達出現上調(均P<0.05),說明莪術醇可能通過改變Bax和Bcl-2蛋白兩者之間的表達比例,激活Caspase-3蛋白,使其執行凋亡功能,實現促凋亡作用。見表7、表8,圖7。

注A 空白對照組;B 莪術醇低濃度組;C 莪術醇中濃度組;D 莪術醇高濃度組;E 陽性對照組。圖7 莪術醇對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

表7 莪術醇對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響

表8 莪術醇對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論

生命活動的正常完成及機體內部平衡和穩態的維持,離不開細胞的有序增殖、分化及凋亡[5]。越來越多的研究發現,腫瘤的發生、發展與細胞凋亡和細胞周期的紊亂有密切關系[6],腫瘤細胞能夠逃逸周期檢查點而無限制地增殖,導致凋亡減少。因此,如果能夠通過藥物來打破這種失控的增殖現象,則可在一定程度上減緩腫瘤的進展。本實驗發現莪術醇呈現出濃度-時間依賴性地抑制胃癌AGS細胞的增殖活性,促進胃癌AGS細胞凋亡,誘導胃癌AGS出現G2/M期、G0/G1期的周期阻滯,并且可以抑制細胞的遷移和修復。據此可推斷莪術醇對胃癌AGS細胞的生長活性的抑制作用可能是通過促進凋亡、抑制遷移和修復以及誘導周期阻滯而實現。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的形式之一,使受損細胞被有效清除[7],維持正常新陳代謝。目前已經發現越來越多的疾病與凋亡異常有關,癌癥為其中的一種。本實驗用莪術醇干預胃癌AGS細胞后呈現出時效-量效依賴性地增加細胞凋亡率。同時,為了探究誘導凋亡發生的可能原因,本研究檢測了Caspase-3、Bax和Bcl-2三個經典凋亡蛋白的表達,發現經莪術醇干預后Bax和Caspase-3蛋白水平明顯上調,Bcl-2蛋白水平明顯下調。Bcl-2蛋白家族在調控細胞的存活和凋亡中起著重要作用,Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白[8]。二者可以在細胞內形成異質二聚體而失活,當兩者相對的比例失衡時,會導致線粒體膜的完整性被破壞,增加線粒體自身的通透性,造成細胞膜內外Ca2+失衡,損傷外膜,釋放出細胞色素C。當細胞色素C進入胞質內后,激活Caspase家族的級聯反應,最終激活凋亡執行蛋白Caspase-3,引起細胞凋亡進程的改變[9-10]。

PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞以及多種腫瘤實體的存活、增殖、分化及促血管生成等多方面起著重要作用[11-12],是一條經典的抗凋亡、促增殖信號通路[13]。該信號通路組成復雜,生物功能廣泛,在胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、卵巢癌等多種癌癥中均可見其調控功能異常[14-17],是臨床上很多疾病治療藥物篩選的靶點。研究發現在胃癌組織中Akt信號通路異常活化,活化后的信號通路影響細胞的正常增殖、凋亡及遷移進程,并且活化的Akt還會進一步將信號向下傳導轉化底物,激活下游的眾多靶蛋白包括mTOR,調控細胞的生長、增殖和分化[18]。因此,PI3K/Akt/mTOR信號通路被作為研究胃癌進展的重要靶點。同時有研究證實,Akt是一個重要的抗凋亡因子,當抑制PI3K/Akt信號通路時,可以抑制腫瘤細胞中Bcl-2蛋白的表達,促進Bax和Caspase-3蛋白表達,從而促進癌細胞的凋亡[19-20]。本實驗發現莪術醇可以顯著抑制胃癌AGS細胞中PI3K/Akt/mTOR信號蛋白的磷酸化水平,上調細胞凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達,下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。因此,莪術醇可能通過失活PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制胃癌AGS細胞的生長,誘導細胞的凋亡。

綜上所述,莪術醇可以通過抑制生存信號通路PI3K/Akt/mTOR的表達來誘導胃癌AGS細胞凋亡增加,阻滯受損細胞的異常增殖,對腫瘤的發生和進展產生明顯的延緩作用,為莪術醇用于胃癌的治療提供了實驗依據。同時,實驗的不足之處為尚未通過體內實驗驗證莪術醇對胃癌AGS細胞的作用是否與體外實驗相一致,以及在莪術醇的作用下PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用是否與其他信號通路交互影響。關于莪術醇對胃癌抗腫瘤作用的具體療效及更深入機制還需要從基因等方面進行探討與證實。