長鏈非編碼RNA Linc00511在肺癌血清中的表達及臨床診斷價值

霍艷，郭紅艷，徐亞茹，李耕慧，孫曉杰，趙正林，吳琦，劉波

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾市第一醫(yī)院老年科，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院辦公室，黑龍江齊齊哈爾 164000

肺癌（lung cancer）是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率高居世界首位，且其發(fā)病率在相當(dāng)長的時間內(nèi)將繼續(xù)呈上升趨勢。盡管肺癌治療手段在不斷更新，但該病總體預(yù)后仍然較差[1]，這與肺癌的發(fā)病機制不清，缺乏有效的早期診斷和預(yù)防手段有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的某些特定LncRNA表達水平會發(fā)生異常改變，LncRNA有可能成為癌癥早期診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物和藥物治療靶點[3-4]。Linc00511在多種腫瘤中表達失調(diào)，與人類惡性腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究通過實時熒光定量PCR方法檢測2017年9月—2018年2月期間，在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院住院的60例肺癌患者及79名同期來院體檢的健康人血清中Linc00511的表達，分析其表達水平與臨床因素的關(guān)系，并評估其作為血清學(xué)標(biāo)志物在肺癌臨床診斷中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性采用本院79名健康人對照組血清樣本和60例肺癌組患者血清樣本為研究對象，對照組中男48名，女31名；平均年齡（56.43±9.07）歲。肺癌組中男35例，女25例；平均年齡（53.73±7.61）歲。入選對象一般資料組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：肺癌病例經(jīng)病理診斷確診；收集血清樣本前未進行手術(shù)、放療和化療等相關(guān)治療；病例臨床診斷和腫瘤分期均按照美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis，TNM）分期系統(tǒng)第六版或組織活檢及影像學(xué)檢查確定。排除標(biāo)準(zhǔn)：有肝、腎功能異常及其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1 血清標(biāo)本收集 收集所有研究對象靜脈血5 mL，室溫靜止1 h后，4℃，3 500 r/min離心10 min，用新管收集上層血清，4℃，12 000 r/min離心10 min，除去細(xì)胞碎片，將樣本置于-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol LS試劑（美國Invitrogen公司）從血清中提取總RNA，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR試劑盒（日本Takara公司）進行cDNA合成，按試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)條件為：37℃、60 min，85℃、5 min，cDNA置于-20℃。

1.3.3 實時熒光定量PCR反應(yīng) qTOWER 3G 實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（德國Jena公司）進行擴增，引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下：GAPDHF：5’-CCTGGTATGACAACGAATTTG-3’；GAPDHR：5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC-3’；Linc00511-F：5’-TCCTCACAGGGGGTAGTAGG-3’；Linc00511-R：5’-CCCTTCTCCCTCGGTCATTT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃、10 s，95℃變性5 s，60℃、20 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，基因相對表達量采用2-ΔΔCt計算。

1.3.4 腫瘤標(biāo)志物CYFRA檢測 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定肺癌和健康對照組血清樣本中范圍為0～3.3 U/mL。

1.4 觀察指標(biāo)

實時熒光定量PCR 檢測血清Linc00511表達水平；受試者工作特征（ROC）曲線、曲線下面積（AUC）、危險分?jǐn)?shù)分析評估Linc00511對肺癌的診斷效能；計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value, PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value, NPV），探討Linc00511獨立及聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的應(yīng)用價值。

1.5 統(tǒng)計方法

細(xì)胞角蛋白片段（cytokeratin fragmen, CYFRA）表達量具體數(shù)據(jù)通過查閱臨床病例資料獲得，采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布的計量資料，以中位數(shù)（第25～75百分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。GraphPad Prism 6進行圖形繪制，并聯(lián)法進行聯(lián)合診斷。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Linc00511在肺癌血清中高表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Linc00511在對照組血清中的相對表達量為0.787（0.397，1.643），在肺癌組血清中的相對表達量為1.933（1.315，3.229），明顯高于前者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-5.939，P＜0.001）。見圖1。

圖1 肺癌病例與正常血清中Linc00511的表達

2.2 Linc00511的血清表達量與臨床因素的關(guān)系

將肺癌組病例分別按照性別、年齡和是否遠處轉(zhuǎn)移情況進行分組，分析Linc00511的血清表達量的組間差異，結(jié)果顯示其血清表達水平在男性（n=35）和女性（n=25）患者血清中的表達量分別為（2.183±1.519）和（2.987±2.014），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.764，P=0.083）；在年齡＜60歲（n=21）和≥60歲（n=39）歲肺癌患者血清中的表達量分別為（2.260±1.534）和（2.393±1.937），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.482，P=0.631）；Linc00511在M0肺癌患者（n=49）血清中的表達量為2.177（1.422，3.570），M1肺癌患者（n=11）血清表達量為1.432（1.219，1.876），二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.226，P=0.026），見圖2。

圖2 Linc00511的血清表達量與臨床因素的關(guān)系

2.3 Linc00511和CYFRA診斷肺癌的ROC曲線分析

將研究對象血清樣本的CYFRA檢測進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示：肺癌組患者CYFRA表達量為2.805（2.085，4.930），對照組CYFRA表達量為2.040（1.470，2.880），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.119，P＜0.01），見圖3A，ROC曲線提示：CYFRA診斷肺癌的曲線下面積（AUC）為0.704（95%CI：0.618～0.790），Linc00511診斷肺癌ROC曲線AUC為0.806（95%CI：0.735～0.877，P＜0.01）。將Linc00511與CYFRA聯(lián)合檢測用于診斷肺癌，ROC曲線AUC為0.859（95%CI：0.799～0.920，P＜0.01），見圖3B。

圖3 Linc00511與CYFRA檢測肺癌ROC曲線分析

2.4 Linc00511和CYFRA診斷肺癌的效能分析

將Linc00511與腫瘤標(biāo)志物CYFRA對肺癌的診斷效能進行比較，結(jié)果顯示，Linc00511診斷肺癌的特異度低于CYFRA，但其診斷的敏感度和NPV高于CYFRA，而二者聯(lián)合檢測的敏感度、特異度、PPV、NPV均高于CYFRA單獨檢測，見表1。

表1 Linc00511、CYFRA單獨及聯(lián)合檢測的臨床診斷效能

3 討論

我國是肺癌的高發(fā)病率國家，該病分別占男、女惡性腫瘤發(fā)病率的第1位和第2位，除影像學(xué)、病理學(xué)檢查外，血清標(biāo)志物檢測是診斷該病重要的輔助檢查，常見的血清標(biāo)志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖鏈抗原125（Carbohydrate antigen 125，CA125）、CYFRA等[5]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠準(zhǔn)確早期診斷該病的單一標(biāo)志物[6-8]，聯(lián)檢模式可提高診斷的效果，探究有價值的生物學(xué)標(biāo)志物對腫瘤靶向治療具有重要意義。

眾多新方法的涌現(xiàn)，使Lnc RNAs在癌癥中的功能逐步被闡明[9-10]。Linc00511在多種腫瘤中表達失調(diào)，絕大多數(shù)文獻支持Linc00511可能作為癌基因發(fā)揮作用的觀點[11-13]，但Linc00511在惡性腫瘤中的生物學(xué)功能有待進一步研究。

目前，Linc00511在肺癌組織及相關(guān)細(xì)胞系中的表達研究較多，有關(guān)肺癌患者Linc00511血清學(xué)檢測的研究國內(nèi)未見報道，Chunlin Li等[14]的研究采用qPCR檢測非小細(xì)胞肺癌患者（62例）和對照組（62例）血清Linc00511的表達水平，并對其分析比較，結(jié)果提示肺癌患者中Linc00511的表達明顯高于健康對照組（P＜0.05），本研究分析60例肺癌組與79名健康對照組血清Linc00511的表達量，結(jié)果同樣提示肺癌組Linc00511表達高于對照組（P＜0.05），該結(jié)論與前述研究結(jié)論具有良好的一致性，此外，本研究還提示受試者血清Linc00511的表達不受性別、年齡因素影響，但與患者轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05），因此，Linc00511有可能作為肺癌的診斷乃至預(yù)后評估的指標(biāo)。

CYFRA是目前臨床上常用的診斷肺癌的血清學(xué)指標(biāo)之一[15]，本研究通過查閱病歷資料，繪制Linc00511與CYFRA診斷肺癌的ROC曲線并進一步分析二者單獨診斷和聯(lián)合診斷效能，結(jié)果提示，二者聯(lián)合檢測靈敏度和特異度分別為53.3%和88.6%，高于CYFRA單獨檢測的41.7%和82.3%；PPV和NPV分別為78.0%和71.4%，高于CYFRA單獨檢測的64.1%和65.0%，即Linc00511與CYFRA聯(lián)合檢測診斷效能高于CYFRA單獨檢測。因此Linc00511在肺癌的診斷中可能具有一定的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究通過檢測Linc00511在肺癌患者血清中的表達水平，分析其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其單獨檢測及與CYFRA聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的臨床價值，為肺癌的分子診斷提供實驗依據(jù)。但是，研究對Linc00511在肺癌診斷中的臨床價值只是做了粗淺探討，研究樣本數(shù)量十分有限，對Linc00511與肺癌其他病理學(xué)特征（如家族史、吸煙史、腫瘤分化程度、病理分期等）的相關(guān)性并未進行深入分析，Linc00511在肺癌中發(fā)揮作用的分子機制研究部分也尚未深入探討，這些還需進行更深入、系統(tǒng)的后續(xù)實驗研究來證實。