產富含甘油二酯的油脂的內生真菌篩選及油脂組成分析

彭 紅,徐文強,何鴻偉,萬 茵,付桂明,畢浩然

1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌 330047

2.南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心,江西 南昌 330047

利用微生物發酵技術是生物合成功能性油脂的一條重要途徑,具有諸多獨特的優點,如產油微生物與陸生作物相比生長時間短、對環境友好、不占用耕地、對食品供應鏈沒有影響等[1]。產油脂微生物包括酵母、藻類、細菌和真菌[2-5],其中絲狀真菌具有一些更加有利的特性,如絲狀真菌細胞更容易收獲,尤其是當它們以小球或菌絲體的形式生長時[3]。有研究表明,產油真菌可以積累大量高價值的多不飽和脂肪酸,如亞油酸[3]、γ-亞麻酸[4]和花生四烯酸[5]。

內生真菌(Endophytic fungi)是指生活史的部分或整個階段生活在植物細胞間或細胞內,宿主植物無明顯感染癥狀的一類真菌。在內生真菌的生長過程中,根據協同進化理論,宿主與內生真菌之間會發生水平基因轉移,內生微生物也能產生與其宿主植物相同的代謝產物[6],如紫杉醇[7]、喜樹堿等[8]。據此推測,眾多油料植物的內生真菌也具有豐富的產脂能力。紅豆杉屬樹種是特殊油脂和一些特殊脂肪酸的良好來源[9-11],因此推測紅豆杉屬植物中的內生真菌具有很強的脂質積累能力。在以往的研究中,紅豆杉內生真菌一般用于生產抗癌藥物紫杉醇[12],關于其內生真菌產油脂的研究很少。

隨著人們生活水平日益提高,越來越多的人正被肥胖問題所困擾。由于過量攝入包括高脂肪食物在內的高熱量食物所導致的肥胖可引起多種疾病,如心血管疾病、骨質疏松癥、大腦萎縮等[13]。甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)作為一種結構脂質,與甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)相比熱量更低,而且將其作為脂肪替代品添加到食品中時,不會破壞產品的質地和感官屬性。同時DAG作為一種抗肥胖劑,能夠降低餐后脂肪酸水平[14]、改善血清膽固醇[15]、降低血糖濃度[16],從而對人類健康產生積極影響[17]。DAG還顯示出促進心血管健康[17]和預防全身炎癥性疾病[18]的潛力。因此DAG作為功能性脂質已引起了人們的廣泛關注。在大豆油、菜籽油、豬油等天然常見動植物油脂中DAG的含量較低,一般不超過10%[19-21]。而傳統的生產DAG的方法如化學法和酶法都存在諸多不足,從而在一定程度上限制了DAG的商業生產[22]。相反,從植物組織中篩選出高DAG含量的內生真菌從某種意義上為生產DAG提供了一種有效的新途徑。

作者從野生南方紅豆杉樹組織中分離篩選出內生真菌菌株,對其進行生物學鑒定,評估內生真菌的產油脂能力,并通過對油脂組成的分析,最終篩選出具有產甘油二酯潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物組織(莖、樹皮和葉子)采集于南昌市梅嶺風景區野生南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)。樣品采集后立即存放在無菌自封袋中并帶回實驗室,于4 ℃保存備用。

正己烷(AR)、三硬脂酸甘油酯(99%)、二油酸甘油酯(99%):上海麥克林生化科技有限公司;酵母浸粉(BR):南京全隆生物技術有限公司;瓊脂粉(MW3 000～9 000)、蛋白胨(BR):北京索萊寶科技股份有限公司;葡萄糖(AR):西隴科學股份有限公司;植物DNA提取試劑盒(通用型)、高純度低電滲瓊脂糖、DL5000 Marker和引物:北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

HHWS-Ⅲ-250恒溫恒濕培養箱:上海躍進醫療器械有限公司;ZWY-240恒溫搖床:上海智城分析儀器制造有限公司;YB-F1-D冷凍干燥機:上海億倍實業有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺:蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠;ATY224電子天平:日本島津公司;2720 Thermal Cycler PCR儀:Applied Biosystems;JY300C電泳儀、JY04S-3C凝膠成像儀:君意東方公司;Advance 6001H NMR核磁共振儀:德國Bruker公司;Agilent 6890N氣相色譜-質譜儀:美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 內生真菌分離純化

南方紅豆杉內生真菌的分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

PDA培養基配方:馬鈴薯葡萄糖26 g/L,瓊脂20 g/L。培養基中添加10 mg/L的鏈霉素和3 mg/L的四環素。培養基配制完成后于121 ℃高壓滅菌20 min,然后倒入9 cm平板中使用。

1.3.2 內生真菌的分離

將采集來的紅豆杉的莖、葉以及樹皮用自來水沖洗3～5 min,除去塵埃雜物,轉移至超凈工作臺內,用無菌濾紙吸干表面水分。進行外植體表面消毒處理,先用75%的乙醇浸泡30～60 s,然后用無菌水沖洗3～5次,接著用2%次氯酸鈉溶液浸泡1～2 min,再用無菌水沖洗3～5次,最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分。用解剖剪和解剖刀將莖、樹皮以及葉子剪成0.5 cm小段,按外植體部位分別接種于已經準備好的PDA固體培養基上,每皿均勻接3塊外植體,每個部位的外植體接4個皿。接入標記完成后將其倒置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養3～10 d,每天觀察記錄菌絲生長情況。

1.3.3 內生真菌的純化

當接種于PDA固體培養基中的南方紅豆杉外植體長出菌絲后,根據所長出的菌落顏色、形態以及分泌物,分別挑取不同菌落菌絲的尖端接種于新的PDA固體培養基上,28 ℃倒置于電熱恒溫培養箱中黑暗培養3～7 d,每天觀察記錄菌絲生長情況,當有不同顏色或形態的菌落生長出來后,繼續以菌絲頂端純化法進行純化操作直至各個菌落為單一純培養為止,然后將純化后的單一菌株分別編碼,記錄備用。

1.3.4 內生真菌的生物學鑒定

真菌菌株生物學鑒定委托北京擎科生物科技有限公司。使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒(通用型)提取菌種樣品的DNA,然后通過引物進行擴增,擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物條帶是否與目的大小相符、是否單一、有無拖帶。PCR產物檢測合格后,切割目的條帶進行純化回收,用回收后的產物進行PCR測序,測序結果用軟件ContigExpress進行拼接,并去除兩端不準的部分。批量對拼接序列進行blastn(最新版本 V2.13)比對核酸數據庫。其中,核酸數據庫選擇最新版本的nt庫,通過與nt庫進行blastn比對,即可得到同源序列的物種鑒定結果。所用鑒定引物如表1所示。

表1 真菌鑒定引物

1.3.5 油脂的提取和組成分析

取培養3～7 d的長有菌絲的各內生真菌的PDA平板,切取2片直徑1 cm的生長均勻的帶培養基的菌塊,然后接入裝有100 mL PDB培養基(馬鈴薯葡萄糖26 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蛋白胨0.5 g/L、酵母提取物0.8 g/L、(NH4)2SO43.0 g/L、KH2PO42.0 g/L)的250 mL三角瓶中,用封口膜封好。將接種后的三角瓶放入恒溫培養箱中發酵培養,28 ℃、120 r/min培養7 d。然后將菌絲體經4層紗布過濾,用蒸餾水洗凈表面培養液后,冷凍干燥48 h后稱質量,測定菌絲體干重,計算生物量。生物量=m1/V,其中,m1為菌絲體干重,g;V為發酵液體積,L。

將凍干的菌絲體充分研磨后用正己烷進行索氏抽提8 h,然后旋轉蒸發去除正己烷得到粗脂肪,計算菌絲體中油脂含量。油脂含量=(m2/m3)×100%,其中,m2為提取的油脂質量,g;m3為真菌菌絲干重,g。

油脂的組成采用1H NMR法確定。1H NMR分析在核磁儀上進行,譜寬10 822 Hz,掃描次數64,脈沖寬度90°。分析前,將10 mg脂質抽出物溶解在425 μL含內標物四甲基硅烷(TMS)的CDCl3中。同時獲得標準品TAG、1,2-DAG、1,3-DAG和MAG的1H NMR譜。

1.3.6 油脂的脂肪酸組成分析

稱取油脂樣品100 mg,加入適量2 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液,50 ℃振蕩10 min,然后加入5 mL正己烷和適量無水Na2SO4,充分振蕩,取上層正己烷層進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件:Agilent 6890N氣相色譜-質譜儀,色譜柱HP-PONA 50 m×0.2 mm×0.5 μm,EI源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,載氣He,載氣流速1.0 mL/min,程序升溫。進樣量1 μL,分流比50∶1。升溫程序:80 ℃保持5 min,然后以4 ℃/min升至290 ℃,保持5 min。

2 結果與分析

2.1 菌種的生物學鑒定

經分離、篩選和純化后獲得18株內生真菌,部分代表性菌落如圖1所示,基本不含有雜菌。

圖1 純化后的部分代表性菌落

提取菌種樣品的DNA,然后使用真菌ITS或細菌16 S的通用引物對其進行擴增測序,利用測序結果在NCBI數據庫(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進行比對,選擇同源度最高的物種,獲得18株菌株的分子生物學鑒定結果如表2所示。編碼為2.S33Y和S331的2個菌株均為鐮刀菌屬真菌;編碼為2.S51和2.S31的2個菌株均為毛色二孢屬真菌;編碼為2.L43、S121和S221的3株菌株均為刺盤孢屬真菌;編碼為S511、S141和S131的3株菌株均為甜櫻間座殼屬真菌,且S141和S131屬于同一種菌株;編碼為B322和B121的2個菌株均為木霉屬真菌;編碼為2.S11、S431、S321、S521、S251和S322的菌株分別被鑒定為擬莖點霉屬、枝孢菌屬、擬盤多毛孢屬、葡萄座腔菌屬、青霉屬和籃狀菌屬。

表2 內生真菌菌種生物學鑒定結果

2.2 真菌油脂的產脂能力分析

篩選出的18株菌株經液態有氧發酵培養7 d后的生物量、油脂含量和油脂產量如表3所示。限制微生物油脂商業化應用的兩個重要因素是固有的產生大量脂質的能力并具有合適的脂肪酸分布和在廉價底物上生長的能力[23]。每種微生物都可以合成脂質,但只有那些脂質積累能夠高達其細胞干重20%的微生物才被稱為產油微生物[24]。從表3可知,篩選獲得的18株菌株中,僅有2.S33Y、2.S31、S321和S331菌株中油脂含量達到了細胞干重的20%,分別為27.60%、21.41%、20.67%和24.73%,其中2.S33Y的油脂含量最高;另有2.S51、S511、B322和B121菌株中油脂含量達到了細胞干重的15%～20%;其余菌株的含油量均低于細胞干重的15%。另外,由于受生物量的影響,干細胞中油脂含量與油脂產量并不完全一致,例如菌株2.S31的油脂產量最大,為1.91 g/L,但其油脂含量只有21.41%。對于菌株2.L43,盡管生物量最高(11.06 g/L),但由于其油脂含量只有14.04%,導致最終油脂產量僅為1.55 g/L。結果表明,在相同的培養條件下,菌株的生長速度與菌細胞中油脂的積累并不完全一致,可能的原因是不同菌株細胞中油脂合成所需的相關酶的活性不同,即代謝差異所導致[25]。

2.3 真菌油脂的組成分析

圖2 含1,3-DAG、1,2-DAG、TAG和MG的標準物的1H NMR譜

圖3 真菌2.S33Y油脂的1H NMR譜

表4 1H NMR譜中油脂主要成分的化學位移和歸屬

在1H NMR譜中峰的積分面積與產生該峰的氫質子的數量相關[27],因此可在此理論基礎上根據1H NMR譜中峰的積分面積定量分析真菌油脂中TAG、DAG、MAG和游離脂肪酸(FFA)的含量。將CDCl3中內標物TMS(化學位移0.00 ppm)的信號的積分值標準化為1.000 00,各甘油酯與游離脂肪酸的物質的量(n)可按式(1)—(6)計算:

n1-MAG=C×A3.91～3.95,

(1)

n2-MAG=(C×A3.82～3.84)/4,

(2)

n1,2-DAG=(C×A3.72～3.74)/2,

(3)

n1,3-DAG=C×A4.05～4.10,

(4)

nTAG=(C×A4.11～4.38-2n1-MAG-2n1,2-DAG-4n1,3-DAG)/4,

(5)

nFFA=(C×A2.28～2.38-6nTAG-4n1,2-DAG-4n1,3-DAG-2n1-MAG-2n2-MAG)/2,

(6)

式中:C為1H NMR譜中信號峰的積分面積和產生該信號峰的質子數量相關聯的比例常數;A為相對應峰的積分面積,例如A3.91～3.95是指在3.91～3.95 ppm的1H NMR峰的積分面積。

MAG、DAG、TAG和FFA的物質的量分數(X)按式(7)—(12)計算:

XMAG=100(n1-MAG+n2-MAG)/(n1-MAG+n2-MAG+n1,2-DAG+n1,3-DAG+nTAG+nFFA),

(7)

X1,2-DAG=100n1,2-DAG/(n1-MAG+n2-MAG+n1,2-DAG+n1,3-DAG+nTAG+nFFA),

(8)

X1,3-DAG=100n1,3-DAG/(n1-MAG+n2-MAG+n1,2-DAG+n1,3-DAG+nTAG+nFFA),

(9)

XDAG=X1,2-DAG+X1,3-DAG,

(10)

XTAG=100nTAG/(n1-MAG+n2-MAG+n1,2-DAG+n1,3-DAG+nTAG+nFFA),

(11)

XFA=100nFA/(n1-MAG+n2-MAG+n1,2-DAG+n1,3-DAG+nTAG+nFFA)。

(12)

根據本團隊前期研究結果,內生真菌微生物油脂的脂肪酸構成主要是C16和C18(≥94%),因此可計算得內生真菌微生物油脂的脂肪酸平均鏈長為17.5,且含十八碳的脂肪酸占總脂肪酸組成的65%以上[30]。因此,為了便于計算,以含有一個雙鍵的油酸(C18∶1)作為參考,按式(13)—(18)計算各甘油酯和游離脂肪酸的質量分數(ω),結果如表5所示。

表5 內生真菌油脂的組成

ωMAG=(XMAG×MMAG)/(XMAG×MMAG+XDAG×MDAG+XTAG×MTAG+XFFA×MFFA),

(13)

ω1,2-DAG=(X1,2-DAG×MDAG)/(XMAG×MMAG+XDAG×MDAG+XTAG×MTAG+XFFA×MFFA),

(14)

ω1,3-DAG=(X1,3-DAG×MDAG)/(XMAG×MMAG+XDAG×MDAG+XTAG×MTAG+XFFA×MFFA),

(15)

ωDAG=ω1,2-DAG+ω1,3-DAG,

(16)

ωTAG=(XTAG×MTAG)/(XMAG×MMAG+XDAG×MDAG+XTAG×MTAG+XFFA×MFFA),

(17)

ωFFA=(XFFA×MFFA)/(XMAG×MMAG+XDAG×MDAG+XTAG×MTAG+XFFA×MFFA),

(18)

式中:MMAG、M1,2-DAG、M1,3-DAG、MTAG和MFFA分別代表甘油一酯、1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯、甘油三酯和游離脂肪酸的平均分子量,取平均烷基鏈長為C18,則MMAG=356.54、MDAG=620.98、MTAG=885.43、MFFA=282.46。

從表5可看出,18種內生真菌油脂中主要含有甘油三酯、甘油二酯和游離脂肪酸,甘油三酯含量大于甘油二酯和游離脂肪酸含量,同時含有少量甘油一酯。18種內生真菌油脂中,來自菌株S511的油脂中甘油三酯含量最高,達到92.25%,根據該菌株中油脂含量18.99%(表3),計算甘油三酯產量也達到最大值1 673.41 mg/L,同時只含有少量的甘油一酯、甘油二酯和游離脂肪酸,說明菌株S511適合于甘油三酯的合成。在相同培養條件下,菌株2.S33Y的甘油二酯產量最高,達到335.22 mg/L;盡管菌株S121的油脂含量和產量分別只有12.41%和1.25 g/L(表3),但來自該菌株的油脂中甘油二酯含量最高,達到19.07%,同時游離脂肪酸含量相當高(19.71%),導致甘油二酯和游離脂肪酸產量均較高,分別為238.95、246.97 mg/L。說明菌株2.S33Y最適合用于生物合成功能性脂質甘油二酯,后續可通過誘變途徑和發酵條件優化進一步提高甘油二酯產量。菌株S431的油脂中雖然甘油二酯含量最高,達到19.20%(表5),但油脂產量極低(0.54 g/L)(表3),同時甘油二酯產量也不高,只有102.91 mg/L(表5)。另外3株菌株S431、S251和S322的油脂中雖然同時含有較多的甘油二酯和游離脂肪酸,但由于油脂含量低于15%,且油脂產量較低,導致甘油二酯和游離脂肪酸產量并不高。菌株2.S31、S321和S331中雖然油脂含量高于20%,但油脂中甘油二酯含量也十分有限。結合表3和表5可知,真菌菌絲體中油脂含量高的菌株并不一定適合于用來生物合成甘油三酯或者甘油二酯。

2.4 油脂的脂肪酸組成

采用GC-MS對從真菌2.S33Y中提取的油脂進行脂肪酸組成分析,結果如圖4所示。真菌2.S33Y油脂主要由棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)組成,含量分別達到29.79%、29.36%、11.07%和27.14%,其中棕櫚酸含量最高,亞油酸含量較高;另含有極少量十四碳酸(C14∶0)、十五碳酸(C15∶0)、十七碳酸(C17∶0)、亞麻酸(C18∶3)、二十碳酸(C20∶0)和二十二碳酸(C22∶0)。真菌2.S33Y油脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量分別為61.52%和38.48%。

圖4 真菌2.S33Y所產油脂的脂肪酸組成

3 結論

從南方紅豆杉樹組織中共分離篩選出18株內生真菌菌株,并經分子生物學鑒定,鐮刀菌屬(Fusarium)、毛色二孢屬(Lasiodiplodia)和木霉屬(Trichoderma)真菌各有2株,刺盤孢屬(Colletotrichum)和甜櫻間座殼屬(Diaporthe)真菌各有3株,其他6株菌株包括擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、青霉屬(Penicillium)等。在相同培養條件下,篩選獲得的18株菌株中,鐮刀菌屬(編碼2.S33Y)菌株中油脂含量最高,達到細胞干重的27.60%,毛色二孢屬(編碼2.S31)真菌的油脂產量最大,為1.91 g/L。由于受生物量的影響,干細胞中油脂含量并不與油脂產量完全一致。

18種內生真菌油脂中主要含有甘油三酯、甘油二酯和游離脂肪酸,甘油三酯含量大于甘油二酯和游離脂肪酸含量,同時含有少量甘油一酯。來自甜櫻間座殼屬(編碼S511)的油脂中有最高的甘油三酯含量,達到92.25%;鐮刀菌屬(編碼2.S33Y)有最高的甘油二酯產量,達到335.22 mg/L;來自枝孢菌屬(編碼S431)的油脂中雖然甘油二酯含量最高,達到19.20%,但該菌株的甘油二酯產量只有102.91 mg/L;菌株2.S33Y最適合于用來生物合成功能性脂質甘油二酯。真菌2.S33Y油脂主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸組成,含量分別達到29.79%、29.36%、11.07%和27.14%。

本研究成功篩選出了產富含甘油二酯的油脂的真菌菌株,為微生物發酵產富含甘油二酯的功能性脂質提供重要技術支持。但甘油二酯含量還不十分突出,今后需通過誘變、基因改造等方法進一步提高真菌油脂中的甘油二酯含量。