大黃魚(yú)魚(yú)卵磷脂與乳清分離蛋白復(fù)合分散液的制備工藝研究

林藝璇,陳宇涵,李 響,陳繼承,梁 鵬

福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002

大黃魚(yú)是我國(guó)產(chǎn)量最大的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一,根據(jù)2022年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[1],福建省大黃魚(yú)產(chǎn)量約21.14萬(wàn)t,占全國(guó)總產(chǎn)量的83%,位居第一。雖然大黃魚(yú)加工業(yè)迅速發(fā)展,但其加工副產(chǎn)物魚(yú)卵仍未有效高值開(kāi)發(fā)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),大黃魚(yú)魚(yú)卵磷脂(Large yellow croaker roe phospholipid,LYCRPLs)富含ω-3多不飽和脂肪酸,如二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA),其中DHA和EPA含量高達(dá)41.90%,占總脂肪酸含量的15.19%[2]。磷脂是雙親性小分子表面活性劑,經(jīng)常被用于降低乳液的界面張力,提高乳液穩(wěn)定性[3]。而且與傳統(tǒng)大豆磷脂和蛋黃磷脂相比,LYCRPLs具有更優(yōu)異的乳化效果,是一種潛在的功能性乳化劑[4]。

乳清分離蛋白(Whey protein isolate,WPI)是從牛奶中提取的一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),常用于乳制品、烘焙等產(chǎn)品,具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[5]。前期研究表明磷脂與蛋白之間存在相互作用,可以協(xié)同促進(jìn)乳液穩(wěn)定[6-8],如吳勁軒等[9]研究發(fā)現(xiàn)磷脂主要通過(guò)疏水相互作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合,從而改變蛋白構(gòu)象,增強(qiáng)蛋白乳液的穩(wěn)定性;Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)磷脂結(jié)構(gòu)中不飽和脂肪酸含量越高,與蛋白之間的相互作用越強(qiáng),制備的乳液穩(wěn)定性也越好。目前,對(duì)磷脂-蛋白復(fù)合穩(wěn)定性的研究多集中于大豆磷脂和蛋黃磷脂,關(guān)于LYCRPLs-WPI分散液的制備工藝尚未見(jiàn)報(bào)道。

作者以LYCRPLs和WPI為原料,以粒徑和澄清指數(shù)為考察指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化分散液的最佳制備工藝,以期利用LYCRPLs與WPI之間的相互作用,提高復(fù)合體系的穩(wěn)定性,從而探討LYCRPLs在乳制品中應(yīng)用的可行性,為其深度開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大黃魚(yú)魚(yú)卵磷脂:實(shí)驗(yàn)室自制;乳清分離蛋白:上海麥克林生化科技股份有限公司;正己烷、95%乙醇、丙酮、疊氮鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP電子分析天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;R-1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HN-3K手持均質(zhì)機(jī):上海汗諾儀器有限公司;Nano-ZS90馬爾文激光粒度儀:英國(guó)Malvern公司;ST2100 pH計(jì):奧豪斯儀器(常州)有限公司;LUMiFuge-111全自動(dòng)穩(wěn)定性分析儀:德國(guó)LUM公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大黃魚(yú)魚(yú)卵磷脂的提取

稱(chēng)取一定量的凍干大黃魚(yú)魚(yú)卵,按照魚(yú)卵質(zhì)量與乙醇體積1∶5(g/mL)加入95%乙醇,在室溫下攪拌2 h后抽濾,所得濾液加入適量的正己烷進(jìn)行提取,重復(fù)2次,將濾液旋蒸得到總脂質(zhì)后溶解于冷丙酮中,放置過(guò)夜可得LYCRPLs沉淀物,即為試驗(yàn)用LYCRPLs樣品,并置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以粒徑和澄清指數(shù)為考察指標(biāo),分別研究pH(5、6、7、8、9)、均質(zhì)時(shí)間(30、60、120、180、240 s)、均質(zhì)速度(8 000、10 000、15 000、20 000、25 000 r/min)、WPI添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)以及LYCRPLs添加量(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)對(duì)LYCRPLs-WPI分散液穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 LYCRPLs-WPI分散液的制備

25 ℃條件下使用磁力攪拌分別將LYCRPLs和WPI溶解在超純水中,調(diào)節(jié)pH值。使用手持均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后得到LYCRPLs-WPI分散液。將0.02%(g/mL)疊氮鈉作為抑菌劑添加到分散液中,制備的待測(cè)樣密封儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.4 分散液粒徑、PDI和Zeta電位的測(cè)定

將待測(cè)分散液樣品用超純水按照1∶50(V/V)稀釋后放入激光粒度儀測(cè)量池中。水相和油相的折射率分別設(shè)定為1.333和1.460。

1.3.5 快速穩(wěn)定性測(cè)定

吸取420 μL待測(cè)分散液樣品于離心管中,通過(guò)全自動(dòng)穩(wěn)定性分析儀測(cè)定其穩(wěn)定性。離心機(jī)通過(guò)連續(xù)記錄樣品透光率的動(dòng)態(tài)變化來(lái)量化分散系統(tǒng)的穩(wěn)定性。儀器操作條件:溫度25 ℃,頻率3 000 r/min,輪廓線(xiàn)30,時(shí)間5 min。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以分散液的粒徑及澄清指數(shù)分別作為響應(yīng)值Y1、Y2,選取對(duì)穩(wěn)定性影響較大的3個(gè)因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.7 分散液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性測(cè)定

在最優(yōu)工藝條件下制備LYCRPLs-WPI分散液,室溫(25 ℃)儲(chǔ)藏28 d。每7 d測(cè)定分散液的粒徑、PDI及Zeta電位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均平行測(cè)定3次,結(jié)果取平均值。采用SPSS 23、Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使用Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值

pH值影響WPI和LYCRPLs之間的相互作用,導(dǎo)致分散液穩(wěn)定性發(fā)生變化。如圖1所示,隨著分散液pH值的不斷增大,分散液的粒徑和澄清指數(shù)均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。pH 7時(shí)達(dá)到最低值,粒徑和澄清指數(shù)分別為(249.5±1.67) nm和0.096±0.004。這可能是因?yàn)樵谄x中性環(huán)境條件下,LYCRPLs的水解常數(shù)增大而發(fā)生水解,其囊泡結(jié)構(gòu)被破壞,WPI暴露發(fā)生聚集,導(dǎo)致粒徑增大;在靠近中性環(huán)境條件下,LYCRPLs先與WPI結(jié)合,避免了WPI之間的相互作用,從而防止因WPI聚集產(chǎn)生絮凝,導(dǎo)致分散液粒徑和澄清指數(shù)增大[11-12]。研究證明,蛋白質(zhì)分散液粒徑的變化與蛋白聚集狀態(tài)直接相關(guān)[13]。pH值越靠近中性,分散液粒徑、澄清指數(shù)越小,穩(wěn)定性良好。因此,選擇制備分散液的最適pH值為7。

圖1 pH值對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響

如圖2所示,隨著均質(zhì)時(shí)間的增加,分散液的粒徑與澄清指數(shù)逐漸降低,穩(wěn)定性逐漸提高。可能是因?yàn)榫|(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)使LYCRPLs和WPI充分結(jié)合,單一的LYCRPLs和WPI顆粒轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)YCRPLs-WPI顆粒,從而提高分散液的穩(wěn)定性[14]。當(dāng)時(shí)間達(dá)180 s后,粒徑和澄清指數(shù)變化較小,表明LYCRPLs和WPI已有效結(jié)合,分散液穩(wěn)定性良好。均質(zhì)時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致設(shè)備產(chǎn)生高溫,影響分散液的穩(wěn)定性,因此,選擇制備分散液的最適均質(zhì)時(shí)間為180 s。

圖2 均質(zhì)時(shí)間對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響

2.1.3 均質(zhì)速度

如圖3所示,均質(zhì)速度對(duì)分散液粒徑和澄清指數(shù)的影響與均質(zhì)時(shí)間相似。隨著均質(zhì)速度的增大,分散液的粒徑和澄清指數(shù)均逐漸減小。這是由于均質(zhì)速度越大,產(chǎn)生的剪切力和作用強(qiáng)度越大,其均質(zhì)效果越好,加快了LYCRPLs-WPI顆粒的形成,使分散液更穩(wěn)定[15]。當(dāng)均質(zhì)速度達(dá)20 000 r/min后,粒徑和澄清指數(shù)變化較小,因此,選擇制備分散液的最適均質(zhì)速度為20 000 r/min。

圖3 均質(zhì)速度對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響

2.1.4 WPI添加量

如圖4所示,隨著WPI逐漸增加,分散液粒徑和澄清指數(shù)均逐漸減小。當(dāng)WPI添加量達(dá)到1.0%后,粒徑變化較小,而澄清指數(shù)略微增加。澄清指數(shù)與分散液的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān),澄清指數(shù)越高表明體系越不穩(wěn)定[16]。當(dāng)LYCRPLs不足與WPI完全結(jié)合時(shí),LYCRPLs-WPI顆粒和單一的WPI顆粒共同存在于分散液中。導(dǎo)致粒徑雖然減小,但是澄清指數(shù)上升,分散液穩(wěn)定性下降[17]。因此,選擇制備分散液的最適WPI添加量為1.0%。

圖4 WPI添加量對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響

2.1.5 LYCRPLs添加量

如由圖5可知,隨著LYCRPLs添加量的增加,分散液粒徑逐漸增加,澄清指數(shù)逐漸減小。可能是因?yàn)楦嗟腖YCRPLs和WPI結(jié)合,分散液中LYCRPLs-WPI顆粒的比例提高,導(dǎo)致粒徑增大[10]。同時(shí),LYCRPLs的雙親結(jié)構(gòu),在阻礙WPI之間聚集的同時(shí),賦予分散液更多的親水基團(tuán),可以提高分散液的穩(wěn)定性[18]。因此,綜合考慮,選擇制備分散液的最適LYCRPLs添加量為0.50%。

在單元信息知識(shí)組織框架中，知識(shí)組織語(yǔ)義化過(guò)程表現(xiàn)在語(yǔ)義聚合層和數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)層之中。從語(yǔ)義聚合到數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，包含了標(biāo)識(shí)層、邏輯層和描述層。

圖5 LYCRPLs添加量對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響

澄清指數(shù)即為不穩(wěn)定性指數(shù),能夠綜合判斷分散液的穩(wěn)定性,澄清指數(shù)越接近0,表示分散液越穩(wěn)定[16]。粒徑是指分散液中顆粒物大小,通常分散液中顆粒物粒徑越小,穩(wěn)定性越高[19]。因此,單因素試驗(yàn)以澄清指數(shù)為主要考察因素,粒徑為次要考察因素。結(jié)果表明,影響分散液穩(wěn)定性的因素由大到小為pH值、LYCRPLs添加量、WPI添加量、均質(zhì)速度、均質(zhì)時(shí)間。同時(shí),在乳制品實(shí)際生產(chǎn)中,牛乳的pH值在7附近[20]。考慮到LYCRPLs-WPI復(fù)合分散液的實(shí)際應(yīng)用,不將pH值作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以分散液的粒徑及澄清指數(shù)分別作為響應(yīng)值Y1、Y2,選取均質(zhì)速度、WPI添加量、LYCRPLs添加量作為自變量A、B、C,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

利用Design Expert 10對(duì)表2進(jìn)行分析,擬合得到二次多項(xiàng)回歸方程:

表2 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

Y1=231.74-13.16A-12.52B+43.34C-2.25AB-1.27AC+8.56BC+2.22A2-8.15B2-9.78C2;

Y2=0.099-0.018A+0.008B-0.033C+0.005AB+0.006AC-0.018BC+0.017A2+0.054B2+0.014C2。

方差分析結(jié)果如表2所示,該模型的決定系數(shù)R12=0.990 1、R22=0.966 3,R2均接近1,表明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值較為接近,該回歸方程的擬合效果較好,能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系。其中,A、B、C、BC均對(duì)粒徑有極顯著影響,C2、AC對(duì)粒徑有顯著影響;A、C對(duì)澄清指數(shù)有極顯著影響,A2、C2、BC均對(duì)澄清指數(shù)有顯著影響。由F可以看出3個(gè)因素對(duì)分散液穩(wěn)定性的影響程度均為C>A>B。綜上,該模型高度擬合,適用于優(yōu)化分散液的制備工藝參數(shù)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

圖6為均質(zhì)速度、WPI添加量、LYCRPLs添加量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。其中WPI添加量和LYCRPLs添加量之間的交互作用最強(qiáng)(圖6(c)、(f)),均質(zhì)速度和LYCRPLs添加量之間的交互作用次之(圖6(b)、(e))。由圖6(a)—(c)可知,隨著均質(zhì)速度的升高、WPI添加量增加、LYCRPLs添加量的減小,粒徑逐漸減小。可能是因?yàn)榉稚⒁褐蠾PI/LYCRPLs顆粒增多導(dǎo)致的結(jié)果[10]。由圖6(d)—(f)可知,隨著WPI添加量的降低、均質(zhì)速度升高、LYCRPLs添加量的增加,澄清指數(shù)呈逐漸減小趨勢(shì)。這可能是因?yàn)檫^(guò)多的WPI無(wú)法穩(wěn)定在分散液中,導(dǎo)致分散液穩(wěn)定性降低[21]。這一現(xiàn)象與單因素試驗(yàn)所得結(jié)果一致,也與表2中的方差分析結(jié)果相符。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸方程預(yù)測(cè)及響應(yīng)面模型分析結(jié)果顯示,當(dāng)均質(zhì)速度23 142.23 r/min、WPI添加量1.016%、LYCRPLs添加量0.632%,此時(shí)分散液理論粒徑為244.7 nm,澄清指數(shù)為0.082。結(jié)合實(shí)際情況將各因素最佳工藝參數(shù)修正為均質(zhì)速度23 000 r/min、WPI添加量1.0%、LYCRPLs添加量0.50%,經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得制備的分散液粒徑為(215.20±2.12) nm,澄清指數(shù)為0.080±0.003,與理論結(jié)果相接近,說(shuō)明該模型效果較好。

2.3 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性分析

由表3可知,儲(chǔ)藏初期(0 d)WPI-LYCRPLs分散液粒徑較小,絕對(duì)電位值較大,分布較均勻。但從第21天開(kāi)始,粒徑和電位均發(fā)生變化,可能是因?yàn)殡S著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),LYCRPLs的囊泡結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致WPI暴露聚集,使分散液粒徑和電位均增大[22-24]。另外,PDI在儲(chǔ)藏期間內(nèi)無(wú)顯著變化。結(jié)果表明,WPI-LYCRPLs分散液在25 ℃能夠保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究以LYCRPLs為對(duì)象,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化了LYCRPLs-WPI分散液的制備工藝。最終確定制備分散液的最優(yōu)工藝條件:均質(zhì)速度23 000 r/min、WPI添加量1.0%、LYCRPLs添加量0.50%,制得的分散液粒徑為(215.20±2.12)nm,澄清指數(shù)為0.080±0.003,與理論值較為接近,且穩(wěn)定性良好。本試驗(yàn)未在牛奶中添加LYCRPLs進(jìn)一步驗(yàn)證,課題組在后續(xù)試驗(yàn)中將進(jìn)行LYCRPLs對(duì)牛奶品質(zhì)影響的研究,加快推動(dòng)LYCRPLs的深度開(kāi)發(fā)。