小麥中玉米赤霉烯酮高靈敏智能POCT技術研究

王 丹,胡小風,王 督,唐曉倩,姜 俊,李培武,張兆威*

1.中國農業科學院油料作物研究所,湖北 武漢 430062

2.湖北洪山實驗室,湖北 武漢 430070

3.西藏大學 生態環境學院,西藏 拉薩 850000

4.農業農村部生物毒素檢測重點實驗室, 農業農村部油料產品質量安全風險評估實驗室(武漢), 國家農業檢測基準實驗室(生物毒素),湖北 武漢 430062

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是真菌產生的有毒代謝產物。小麥是一種重要的農作物,也是受ZEN污染的主要糧食作物之一。全世界范圍內均有ZEN污染報道,我國對糧食和飼料中ZEN污染調查分析顯示陽性檢出率可達100%[1]。

ZEN具有非類固醇雌激素作用,影響生殖細胞分化,破壞細胞內遺傳物質,甚至引起動物死亡[2]。食用含有ZEN的小麥及制品會引起中樞神經系統的中毒癥狀,如惡心、神智抑郁和共濟失調等[3]。GB 2761—2017中規定小麥和小麥粉中ZEN的最高限量為60 μg/kg。目前,ZEN檢測方法有精密儀器分析法、生物傳感器法和免疫分析法。精密儀器分析法有高效液相色譜法[4]、氣相色譜質譜法[5]和薄層色譜法等[6],具有分析較迅速和檢測限低等特點;生物傳感器法主要有電化學生物傳感器法、光學生物傳感器法、測溫生物傳感器法和壓電生物傳感器法等,具有選擇性好等特點[7];常用的免疫分析法有酶聯免疫分析法[8]和膠體金免疫分析法[9]等,具有專一性高和特異性強的優點。

隨著檢測需求的提升,傳統方法的靈敏度和智能程度已無法滿足需求,精密儀器分析法步驟復雜,無法實現現場檢測[10];生物傳感器法存在結合效率低和穩定性易受到干擾等問題[11];免疫分析法也存在靈敏度低和智能化差的問題[12]。因此,亟須研究ZEN高靈敏檢測技術,實現ZEN的早檢測和早發現。

納米標記材料乳膠微球(latex microsphere,LMs)具有顏色豐富、大小均勻和比表面積大的特點,為偶聯抗體提供了豐富的位點。基于乳膠微球抗體探針的檢測技術具有良好的穩定性與較高的靈敏度[13]。銪(Eu)是一種量子產率高、帶寬窄、發射壽命長、體積大的元素,因其斯托克斯位移大和低毒等特點被廣泛應用于免疫分析[14]。Eu能有效避免背景熒光的干擾,用其制備的熒光氧化物乳膠微球具有顏色鮮艷、粒徑均勻和單分散性好的優點,使得基于氧化銪乳膠微球抗體探針在ZEN快速智能檢測中具有結果重復性高、準確和靈敏度高等優點。作者在前期自主研發ZEN高親和力抗體的基礎上,研發了熒光定量高靈敏智能即時檢測(Point-of-care testing, POCT)技術。通過優化條件獲得了基于乳膠微球抗體探針的POCT技術的線性范圍、最低檢測限(LOD)和加標回收率,評估了其重復性(批內)和再現性(批間),為真菌毒素等危害因子檢測提供了通用型技術平臺和糧食減損智慧監管技術方法。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

氧化銪乳膠微球:上海優你生物科技股份有限公司;卵清蛋白(OVA)、羊抗鼠免疫球蛋白(IgG):武漢博斯特生物科技有限公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)、嘔吐毒素(DON)、伏馬菌素B1(FB1)、雜色曲霉毒素(ST)、蛇形霉素(DAS)、環匹阿尼酸(CPA):Sigma-Aldrich公司。

樣品墊(GFCP000800玻璃纖維、fusion3、fusion5、濾血膜)、吸水墊:上海金標生物科技有限公司;HF135硝酸纖維素(nitrocellulose membrane,NC)膜:Millipore公司;FF120 NC膜:Whatman國際有限公司;CN95 NC膜:Sartorius公司;超純水:Milli-Q系統。

1.2 儀器與設備

超聲細胞破碎儀:美國SONICS公司;恒溫孵育器:杭州瑞誠儀器有限公司;自制的智能檢測設備:中國農業科學院油料作物研究所;LCMS-8060 UPLC-MS/MS儀:日本Shimadzu公司;試驗篩:北京盛田嘉源科技有限公司;FEI tecnai G2 F30透射電子顯微鏡:美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 智能檢測設備的設計

自制的智能檢測設備結構設計如圖1所示,檢測時,打開鋰電池的開關,電量顯示器亮起,風扇排風。將數據線插頭與數據口連接,將lightning接口/type-c接口/micro-USB與智能手機連接,將待測試紙條插入試紙條卡槽中,通過智能手機上的軟件控制LED光源(Ex=365 nm)照射到試紙條上,攝像頭采集圖像,再通過應用進行解析可得待測物含量。

1.外殼;2.內置攝像頭;3.LED光源;4.電量顯示器;5.數據口;6.智能手機;7.lightning接口;8.type-c接口;9.micro-USB接口;10.數據線插頭;11.電源口;12.鋰電池;13.風扇;14.試紙條卡槽

1.3.2 ZEN抗體制備和鑒定

根據本實驗室前期的報道進行ZEN抗體的制備和鑒定[15]。

1.3.3 氧化銪乳膠微球-抗體探針的研制

用于偶聯ZEN單克隆抗體的氧化銪乳膠微球在可見光照射下呈白色,在紫外光照射下呈明亮的橘紅色,激發波長365 nm,發射波長613 nm。氧化銪乳膠微球與ZEN單克隆抗體偶聯步驟:取800 μL 0.2 mol/L pH 8.0的硼酸緩沖液,加入200 μL氧化銪乳膠微球,振蕩混勻,用超聲細胞破碎儀超聲4 s;加入一定體積的EDC溶液(20 mg/mL),渦混勻15 min;離心10 min(13 300 r/min,10 ℃),棄去上清液;將沉淀用1 mL硼酸緩沖液重懸,振蕩混勻,再用超聲細胞破碎儀超聲4 s;加入一定量的ZEN單克隆抗體溶液,渦旋混勻,10 ℃旋轉混勻12 h;離心10 min(13 300 r/min,10 ℃),棄去上清液,加入1 mL 0.5%的牛血清白蛋白(BSA)溶液重懸,渦旋混勻,10 ℃旋轉混勻2 h(250 r/min);4 ℃保存待用。

在ZEN單克隆抗體標記熒光探針的制備過程中,EDC用量會影響氧化銪乳膠微球的活化程度,因此要對EDC用量進行優化。加入不同物質的量的EDC水溶液,根據試紙條檢測線(T線)和質控線(C線)熒光強度選擇最佳EDC用量。

1.3.4 POCT法檢測條件的影響因素分析

配制1.0 mg/mL的ZEN單克隆抗體水溶液,在最佳EDC用量及氧化銪乳膠微球封閉液條件下,偶聯抗體用量設置為10、20、40、80 μL,通過T/C優化出最佳抗體用量。

T線包被質量濃度優化:將不同質量濃度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL)的ZEN-OVA包被于NC膜T線處,取氧化銪乳膠微球偶聯的單克隆抗體于微孔中,插入試紙條進行反應,檢測系列ZEN標準品,根據靈敏度選擇ZEN-OVA最佳包被質量濃度。

C線包被質量濃度優化:將不同質量濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的羊抗鼠IgG包被于NC膜的C線位置,取氧化銪乳膠微球偶聯的單克隆抗體于微孔中,插入試紙條進行反應,根據C線熒光強度選擇IgG最佳包被質量濃度。

1.3.5 POCT法原材料的優選

使用fusion3、fusion5和濾血膜3種樣品墊;CN95、FF120和HF135 3種NC膜,按照上述優化條件,用ZEN系列標準品溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL)點樣,觀察熒光氧化銪乳膠微球在NC膜上的移動速度、背景是否干凈等;反應結束后,采用自制的智能檢測設備讀數,考察線性范圍和相關系數等,優選出合適的樣品墊和NC膜。

選擇合適的樣品墊和NC膜,在塑料襯板上由下至上依次粘貼樣品墊、NC膜和吸水墊,相鄰各墊在連接處交疊1 mm,檢測墊以NC膜為基墊,自下而上設置橫向T線和C線。使用BioDot XYZ 3050劃膜儀,以0.7 μL/cm的速率劃膜,劃好T線和C線后,37 ℃烘箱處理1 h,取出切條(寬4 mm),4 ℃密封保存。

1.3.6 樣品前處理

將小麥粉碎成粉末,過試驗篩(1 mm孔徑)后稱取小麥粉末25 g,加入100 mL乙腈/水(體積比為60∶40)[16],高速均質3 min(15 000 r/min),過濾后取濾液1 mL加入3 mL樣品稀釋液,混勻待測。

1.3.7 POCT法與UPLC-MS/MS法比對驗證

提前將未使用的試紙條及配套試劑從冰箱中取出平衡至室溫。將一定量的BSA、吐溫-20(Tween-20)、蔗糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK-30)等化學試劑根據不同配比溶解于PBS緩沖液中,配制成樣品稀釋液。將樣品稀釋液加入試樣微孔中,加入抗體標記的氧化銪乳膠微球,混勻,用自制的智能檢測設備進行測試,根據背景干擾、T線和C線的清晰程度確定最佳的樣品稀釋液配方。在最佳樣品稀釋液條件下進行檢測,取混合后的待測樣液與標記抗體的氧化銪乳膠微球加入微孔中,插入試紙條,于恒溫孵育器中37 ℃反應10 min[17],將試紙條放入自制的智能檢測設備中讀取T線和C線熒光值。對于UPLC-MS/MS檢測,濾液用0.22 μm有機過濾器進行過濾,然后注入UPLC-MS/MS進行檢測。

1.4 方法學評價

1.4.1 校準曲線與最低檢出限

在陰性小麥樣品提取液中加入系列質量濃度(0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.4 ng/mL)的ZEN標準品,然后將待測液加至試紙條的樣品孔中37 ℃反應10 min,用自制的智能檢測設備讀取T線和C線熒光值,計算T線與C線的信號強度比值,以ZEN質量濃度的常用對數為橫坐標,以T線與C線的信號強度比值為縱坐標,建立校準曲線。

取21組空白小麥樣品用試紙條進行檢測,通過公式“LOD = 3δ/s”計算最低檢出限(LOD),其中,δ為21個空白樣品值的標準差,s為靈敏度,即校準曲線的斜率[18]。

1.4.2 重復性與再現性

用批內差異和批間差異評價智能POCT技術的重復性和再現性。以陰性小麥樣品提取液為基質,添加ZEN標準品使其質量濃度為2.0 μg/kg。采用同一批次的ZEN試紙條重復6次檢測,并用自制的智能檢測設備讀取結果作為批內差異數據;采用6個批次的ZEN試紙條進行檢測,并用自制的智能檢測設備讀取結果作為批間差異數據。

1.4.3 穩定性

測試本研究的試紙條在180 d內是否有效,將試紙條密封儲存在4 ℃的冰箱中,每30 d取出測試,考察其穩定性。

1.4.4 特異性

配制ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS、CPA 9種毒素的標準溶液1 ng/mL,用建立的智能POCT技術進行特異性驗證。

1.4.5 與UPLC-MS/MS對比驗證

用建立的智能POCT技術與UPLC-MS/MS進行比對,驗證該技術的準確性,從而評估其檢測實際樣品的可行性。UPLC-MS/MS采用多反應監測模式(MRM),色譜分離柱為Thermo C18色譜柱(2.7 μm,10 cm),柱溫40 ℃。流動相A為水,流動相B為乙腈。采用梯度洗脫程序:0～1 min,25% B;1～3 min,70% B;3～4 min,70% B;4～5 min,25% B。洗脫流速 300 μL/min,進樣量1 μL,運行時間5 min。離子源為電噴霧離子源(ESI),質量分析器為三重四極桿,電離方式為電噴霧電離(ESI-)。毛細管電壓3.0 V,源溫度150 ℃,去溶劑化溫度350 ℃。氬氣用作碰撞氣體(碰撞池,0.8 V),氮氣用作霧化氣體(50 L/h)和去溶劑化氣體(650 L/h)。

1.5 數據處理與分析

使用LabSolution 5.89對UPLC-MS/MS所得數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 EDC、ZEN抗體、ZEN-OVA和羊抗鼠IgG的用量

圖2為氧化銪乳膠微球的透射電子顯微鏡圖,此微球尺寸均一、圓形、粒徑200 nm左右。當加入EDC體積中的物質的量大于或等于氧化銪乳膠微球表面的羧基物質的量時,氧化銪乳膠微球才能得到充分活化。當加入的抗體量一定時,在一定范圍內,EDC的用量越多,與抗體偶聯的氧化銪乳膠微球數量越多,試紙條上T線和C線的熒光強度越強。當加入40 μL 20 mg/mL EDC水溶液時,試紙條T線和C線的熒光強度最合適(圖3(a)),因此,40 μL 20 mg/mL EDC為最佳劑量,能確保氧化銪乳膠微球的充分活化。智能POCT技術的靈敏度受抗原和抗體用量的影響較大,通過T/C優化出1.0 mg/mL ZEN抗體最佳用量為20 μL(圖3(b))。測試NC膜T線處包被不同質量濃度ZEN-OVA的試紙條,根據試紙條的靈敏度選擇0.5 mg/mL ZEN-OVA為T線的最佳包被質量濃度(圖3(c));測試NC膜的C線處包被不同質量濃度IgG的試紙條,根據試紙條上C線熒光強度選擇0.2 mg/mL IgG為C線的最佳包被質量濃度(圖3(d))。

圖2 氧化銪乳膠微球的透射電子顯微鏡圖

注:(a)EDC;(b)ZEN抗體;(c)ZEN-OVA;(d)羊抗鼠IgG。

2.2 試紙條原材料的選擇

對樣品墊種類和NC膜種類進行優化以獲得更好的T線和C線熒光強度。通過熒光信號測試評估了T線和C線的性能(表1)。樣品墊和NC膜對顯色和線性的檢測結果顯示FF120 NC膜和fusion5樣品墊的顯色速度較快,背景清晰干凈且線性良好。所以選擇fusion5樣品墊與FF120 NC膜,以保證T線和C線的熒光強度。

表1 試紙條原材料的選擇

2.3 樣品稀釋液

在免疫層析中,用樣品稀釋液稀釋樣品,再與氧化銪乳膠微球混合后進行層析反應。樣品稀釋液的作用主要有:降低樣品中有機相的濃度;提供穩定的pH值,保護抗體活性;使氧化銪乳膠微球均勻分散。因此,研究了各種樣品稀釋液配方對免疫層析結果的影響。結果表明:當樣品稀釋液組成為“1% 蔗糖+0.5% BSA+2.5% Tween-20+0.5% PVPK-30的PBS(pH 7.4)溶液”時,T線熒光強度最高、最清晰,背景值最小,層析效果最好。蔗糖可以增加親水性及增加蛋白穩定性并維系蛋白結構;BSA可以消除非特異性吸附、降低背景信號、保護抗體活性及分散氧化銪乳膠微球顆粒;Tween-20為表面活性劑,可作為增溶劑和親水劑,使活性蛋白的結合位點充分暴露,促進抗原抗體結合反應;PVPK-30是一種大分子聚合物,可作為增稠劑,幫助氧化銪乳膠微球均勻分散并在溶液中保持懸浮狀態。

2.4 方法學評價

用智能檢測設備讀取系列校準液每個濃度點的T/C值。將每個濃度點的T/C作為縱坐標,ZEN質量濃度的常用對數作為橫坐標,以最小二乘法繪制校準曲線(圖4),得到校準曲線方程Y=-0.894 8X+0.457 2,R2=0.982 3。ZEN的LOD由公式LOD=3δ/s計算得出,ZEN在小麥基質中的LOD為0.02 ng/mL,線性范圍0.2～2.4 ng/mL,顯著高于酶聯免疫分析法和膠體金免疫分析法等分析方法的靈敏度(表2)。

表2 本方法與其他ZEN分析方法的比較

注:ZEN質量濃度分別為0.2、 0.3、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、1.4、 1.8、 2.4 ng/mL;內插圖為檢測小麥基質中ZEN的試紙條照片。

采用同批次試紙條檢測了6次加標的小麥樣品。ZEN加樣回收率為95.2%～104.2%,變異系數(CV)為5.5%,表明智能POCT技術具有良好的重復性;使用6個批次的試紙條檢測了小麥加標樣品,ZEN加樣回收率為92.3%～107.5%,CV為3.4%,表明智能POCT技術具有出色的再現性。試紙條的穩定性試驗得到加樣回收率為95.2%～103.2%,表明試紙條在180 d內具有良好的穩定性。

為了證明智能POCT技術可以用于ZEN的快速檢測,通過比較ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS和CPA 9種不同真菌毒素的熒光信號驗證測試條的特異性(圖5)。制備每種真菌毒素的質量濃度為1 ng/mL,進行特異性驗證,對比發現測試條帶對ZEN有很好的選擇性。

圖5 試紙條特異性分析

2.5 與標準方法比對驗證

對空白小麥樣品分別進行了高中低質量濃度的加標回收試驗,通過智能POCT技術與UPLC-MS/MS進行比對,進一步驗證智能POCT技術的準確性。ZEN的UPLC-MS/MS定量和定性離子對見表3。

如表4所示,智能POCT技術檢測加標小麥樣品中ZEN的回收率為104.9%～110.3%。相比之下,UPLC-MS/MS法檢測加標小麥樣品中ZEN的回收率為103.6%～105.7%,兩種方法的檢測結果符合率較高。兩種方法的RSD均低于6%,結果表明所提出的ZEN智能POCT技術準確可靠。

表4 ZEN在小麥中的加標回收率

3 結論

研發了一種靈敏、快速、簡便的測定小麥中ZEN的高靈敏智能POCT技術,準確性和可靠性高。基于抗原抗體的特異性免疫反應原理,采用高靈敏度氧化銪乳膠微球作為示蹤物來標記抗體,采用智能手機進行現場檢測。檢測小麥基質中ZEN,其LOD為0.02 ng/mL,線性范圍為0.2～2.4 ng/mL,加樣回收率為104.9%～110.3%,批內重復性和批間再現性分別為95.2%～104.2%和92.3%～107.5%。該方法操作簡便,所需時間短,與UPLC-MS/MS方法檢測結果一致,為真菌毒素快速智能檢測提供了通用型技術平臺。本研究自制的智能檢測設備和智能手機之間現只能使用有線傳輸數據,下一步研究可改進為藍牙或Wi-Fi連接,提高智能化程度;此外,還可以建立數據儲存云平臺,有利于政府部門智慧監管。