適配體功能化二氧化鈦基復合光催化劑選擇性降解黃曲霉毒素B1作用研究

李佳駿,孫淑敏,楊佳毅,謝巖黎

河南工業大學 糧油食品學院 河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室,河南 鄭州 450001

TiO2光催化降解是一種新型高級氧化技術,主要利用光催化劑在太陽光下生成空穴與電子,電子與水或氧反應生成超氧自由基或羥基自由基,通過自由基反應將有機物降解為小分子化合物、CO2和H2O等[5],具有操作簡便、無二次污染、可直接利用太陽光、降解徹底、運行成本低等優點。但單一的TiO2量子效率和可見光活性較低,常通過摻雜、半導體復合、表面光敏化等方式提高TiO2光催化材料的催化活性[6],其中與磁性石墨烯(MGO)的復合備受關注。MGO不僅具有優異的導電性、較好的磁性,且具有較大的比表面積,這些優點利于反應物在TiO2表面聚集,提高TiO2中的光生電子和光生空穴的傳輸速率且降低TiO2的禁帶寬度[7],從而顯著增強光催化效率和可見光活性,通過外部磁力也解決了復合材料難分離的現象。但是,MGO/TiO2光催化劑自身選擇性和專一性較差,在復雜的食品基質體系中,可能會引起有機組分的改變或破壞。此外,普通的光催化材料因缺少特異性,導致體系中較低濃度的反應物往往在競爭中處于劣勢而不能被有效降解[8]。因此,可通過在光催化材料表面修飾能與目標污染物特異性作用的基團,實現對低濃度目標物的選擇性優先降解。

核酸適配體(Aptamer)作為一種新型分子識別元件,被譽為 “人工抗體”,是近年來研究的熱點之一[9]。適配體在親和力高、特異性強的基礎上還具有可人工合成、成本低、穩定性好、靶分子廣泛、易修飾等眾多優勢,已在疾病檢測、新藥研發、化學分析、食品安全等多個領域廣泛應用[10-11]。目前,核酸適配體在真菌毒素領域的應用主要集中于分析檢測方面,已開發出一系列基于核酸適配體的AFB1檢測方法[12-13]。此外,還有研究報道利用適配體修飾固相載體(硅、瓊脂糖、聚苯乙烯等)作為固相萃取的吸附劑或制備適配體親和色譜,對食品、環境和生物研究中小分子污染物進行目標性富集與凈化[14-15]。基于此思路,作者利用核酸適配體對光催化材料進行功能化修飾,通過與適配體的特異性結合作用,實現混合體系中AFB1的選擇性降解,并增強低濃度目標物的降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1標品:美國Sigma公司;氧化石墨烯:深圳市圖靈進化科技有限公司; 鈦酸四丁酯、正己烷、異丙醇、無水乙醇:天津科密歐化學試劑有限公司;甲醇、乙腈:色譜級,天津四友化學品有限公司;N-羥基琥酰亞胺磺酸鈉鹽(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC):麥克林生化科技有限公司;試驗用水均為超純水。

氨基修飾的熒光標記AFB1適配體序列:(5′-NH2-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-FAM -3′(NH2-aptamer-FAM)[16],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并純化。

1.2 儀器與設備

250 W 高壓汞燈:上海亞明照明有限公司;KH-100水熱反應釜:上海弘瑞儀器設備有限公司;CL8R離心機:湘儀離心機儀器有限公司;Gemini 300掃描電子顯微鏡:德國Carl Zeiss公司;ALPHA傅里葉紅外光譜儀:德國Bruker公司;HS3120 超聲波清洗機:北京天地普和有限公司;1290( FLD 檢測器)高效液相色譜儀:美國Agilent公司;TalosF200x透射電子顯微鏡:美國FEI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MGO/TiO2-aptamer 復合材料的制備

參照課題組前期所使用的方法制備磁性氧化石墨烯復合二氧化鈦材料(MGO/TiO2)[17]。將MGO/TiO2(2 mg/mL)懸浮液超聲1 h,加入NaOH(150 mg)和氯乙酸(100 mg),超聲12 h。使用10 mol/L 的NHS和EDC對MGO/TiO2表面羧基進行活化處理后用純凈水沖洗,其中EDC與NHS溶液體積比為1∶2.5。將20 μL核酸適配體(NH2-aptamer-FAM)探針溶液(1.0 μmol/L )加入500 μL 活化后的MGO/TiO2懸浮液中,振蕩10 min,加入50 μL 20 mmol/L Tris-HCl溶液,室溫反應60 min。反應結束后,用磷酸緩沖液(pH 7.4)洗滌,去除沒有結合的適配體。最后,用超濾膜(10 kDa)過濾并冷凍干燥[18],獲得MGO/TiO2-aptamer粉末。

1.3.2 MGO/TiO2-aptamer 復合材料的表征

采用掃描電子顯微鏡對MGO/TiO2-aptamer的微觀構造以及表面形態進行分析。采用紅外光譜儀對樣品的傅里葉紅外光譜進行分析。采用透射電鏡對核酸適配體功能化MGO/TiO2材料的元素組成進行分析。

1.3.3 AFB1的 HPLC 色譜檢測條件

液相色譜柱:C18( Welch,XB-C18,4. 6 mm ×250 mm×5 μm);進樣量10 μL,柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min;流動相:V( 0.1%甲酸水)∶V(乙腈) = 55∶45;熒光檢測器激發波長設為360 nm,發射波長設為440 nm。

1.3.4 MGO/TiO2-aptamer對AFB1降解增強作用研究

設置 AFB1標準溶液質量濃度組:低濃度組(0.5 μg/mL)、中等濃度組(1.0 μg/mL)和高濃度組(2.5 μg/mL),分別用適配體功能化MGO/TiO2、未修飾的MGO/TiO2各6 mg進行光催化試驗,采用高壓汞燈進行光照,并間隔30 min取樣,6 000 r/min離心3 min,然后取上清液過0.22 μm有機系濾頭,使用HPLC測定樣液中的AFB1含量。

1.3.5 MGO/TiO2-aptamer對AFB1降解選擇性研究

分別取相同質量濃度的AFB1、DON(2.5 μg/mL)各150 μL配制成混合毒素溶液,加入 MGO/TiO2-aptamer與未修飾的MGO/TiO2各6 mg進行光催化試驗,方法同1.3.4,使用HPLC分別測定樣品中的 AFB1和DON含量。

1.3.6 不同因素對 MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影響

將10 mL AFB1標準溶液(2.5 μg/mL)和一定量的MGO/TiO2-aptame加入光催化反應裝置中,方法同1.3.4,使用HPLC測定樣液中的AFB1含量。平行3次試驗,考察適配體濃度( 1、2、4 μmol/L)、催化劑用量( 4、6、8、10 mg)、降解時間(0、30、60、90、120、150 min)及溶液 pH 值(1、3、5、7)對AFB1降解作用的影響。

1.3.7 MGO/TiO2-aptamer 對AFB1光催化降解動力學行為分析

分別稱取6 mg MGO/TiO2-aptamer,再用甲醇配制質量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的 AFB1標準溶液10 mL備用,加入光催化劑材料后按照1.3.4中的方法進行試驗,使用HPLC測定AFB1含量,平行3次試驗,模擬MGO/TiO2-aptamer對AFB1光催化降解動力學行為。光催化反應的動力學行為使用 Langmuir-Hinshelwood(L-H)動力學表達式進行分析,簡化模型方程:

ln(C0/C)=kKt=Kat,

式中:C0為AFB1標準溶液的初始質量濃度,μg/mL;C為t時刻的質量濃度,μg/mL;k和K分別為理論一級速率常數和表面吸附平衡常數,mL/μg;Ka為表觀速率常數,min-1;t為反應時間,min。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 25.0 進行數據分析,使用Origin 2022制圖。

2 結果與分析

2.1 MGO/TiO2-aptamer 復合材料的表征

圖1(a)和(b)為MGO/TiO2和MGO/TiO2-aptamer復合材料的SEM圖。圖1(a)表明,不規則的球形顆粒TiO2與Fe3O4發生了一定程度的聚集,并相對均勻地分散在片層MGO上。由圖1(b)可知,核酸適配體功能化MGO/TiO2的過程使TiO2在MGO表面分散得更加均勻,可能是環氧基與羥基的羧基化過程中大量的超聲導致,且沒有破壞復合材料的基本形貌。

注: (a) MGO/TiO2微觀形貌; (b) MGO/TiO2-aptamer微觀形貌; (c) 兩種復合材料FTIR光譜; (d)-1復合光催化劑全部元素映射圖、(d)-2核酸適配體特有磷元素映射圖、(d)-3核酸適配體特有氮元素映射圖。

注:內插圖為不同光催化材料降解0.5 μg/mL AFB1的效果。

如圖1(c)所示,MGO/TiO2-aptamer復合材料和MGO/TiO2的FTIR光譜在3 455 cm-1處的寬峰可歸因于O—H的伸縮振動[19];廣泛的Ti—O—Ti與Ti—O—C鍵吸收峰出現在500 cm-1與1 634 cm-1左右,表明TiO2已成功負載到MGO上[20]。此外,MGO/TiO2-aptamer材料在1 240～1 500 cm-1有明顯的伸縮振動峰,歸因于適配體的堿基,而2 927 cm-1附近的弱吸收峰歸因于CO—NH[21],證明MGO/TiO2上的羧基與適配體上的氨基鍵合成功,得到MGO/TiO2-aptamer材料。用元素映射圖譜進一步表征,由圖1(d)可知,MGO/TiO2-aptamer具有Ti、Fe等元素,證明MGO/TiO2材料制備成功;具有核酸適配體特有的N、P元素,進一步證明MGO/TiO2-aptamer制備成功。

2.2 MGO/TiO2-aptamer對AFB1降解增強作用及特異性分析

圖 2 顯示了MGO/TiO2-aptamer對低、中、高濃度組AFB1標準溶液的降解效果,結果表明適配體功能化MGO/TiO2后對AFB1的降解率均高于未經適配體修飾的材料(P<0.05)。MGO/TiO2-aptamer對初始質量濃度為0.5 μg/mL的AFB1標準溶液降解增強效果最明顯,降解率提高約15.2%。從而可以證明適配體對MGO/TiO2材料的功能化可以有效提高對低濃度毒素的降解效果。

由圖3可知,分別向AFB1與DON混合毒素溶液中加入MGO/TiO2與MGO/TiO2-aptamer 后,MGO/TiO2對AFB1及DON降解率無明顯差別,分別為71.6%、66.4%,但MGO/TiO2-aptamer對AFB1及DON降解率差異明顯,分別為87.1%、38.6%,核酸適配體功能化的MGO/TiO2對AFB1具有更好的降解效果,而對DON的降解率明顯下降,從而驗證適配體功能化MGO/TiO2對AFB1具有選擇性降解效果。

圖3 MGO/TiO2-aptamer 對 AFB1 的特異性降解

2.3 不同因素對MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影響

如圖4(a)所示,不同濃度的適配體功能化MGO/TiO2對AFB1光催化降解率均高于MGO/TiO2,尤其在前30 min的降解時間內,AFB1降解率迅速升高,表明適配體的功能化加快了對目標物的捕捉和降解進程;當適配體濃度為1 μmol/L時,其復合材料對AFB1的降解率一直保持最高,隨著適配體濃度增加,降解率反而有所下降,這可能是因為過多的適配體會占據更多活性位點,使復合材料接受光照能力變弱。綜上考慮,選取后續試驗所用適配體濃度為1 μmol/L。

圖4 不同因素對MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影響

如圖4(b)所示,降解前30 min降解率陡增,AFB1被催化劑表面的活性位點以及適配體捕捉;降解時間延長至60 min 時,由于催化劑表面空白活性位點數目減少降解率增加緩慢;當降解時間達到120 min,降解趨勢整體變平緩,表明光降解過程接近于平衡狀態。此外,AFB1的降解率隨催化劑用量的增加而增加,當催化劑用量6 mg、降解時間120 min時,降解率達到98.3%,再增加催化劑的用量,AFB1的降解率反而有所下降,過多的催化劑會導致反應體系透光率下降,抑制催化劑對光子的吸收。因此,選擇光催化劑添加量6 mg、光照時間120 min作為優化降解條件。當催化劑用量為6 mg時,MGO/TiO2-aptamer 對AFB1的降解率(98.3%)與 MGO/TiO2(85.7%)相比顯著增強,再次表明適配體功能化可明顯加快光催化反應的進程,提升光催化降解效率。

如圖4(c)所示,由于強堿性溶液對 AFB1結構有破壞作用使其迅速分解,因此主要考慮在pH≤7條件下對 AFB1降解效果的影響。光催化劑在酸性溶液中的降解率明顯高于中性溶液的降解率。當pH 3且光照時間120 min時,降解率已高達97.6%,而此時在中性溶液中降解率僅為77.2%,表明酸性環境有助于加快光催化降解AFB1的進程。可能是因為在酸性條件下,溶液中H+含量較高,促使化學平衡朝著正方向進行,有利于生成具有強氧化作用的 H2O2和·OH,進而提高了AFB1的光催化降解[22]。

2.4 MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的動力學行為分析

MGO/TiO2-aptamer 對不同初始質量濃度的 AFB1降解情況如圖5所示。隨著光照時間的增加,不同質量濃度標準溶液的降解率均呈逐步增高的趨勢,初始質量濃度2.5 μg/mL的AFB1標準溶液降解率最高,達98.3%。但AFB1標準溶液中毒素含量過高時,因無法滿足降解反應體系中所需氧化自由基活性位點,使降解效果變差。

圖5 MGO/TiO2-aptamer 對不同初始質量濃度 AFB1 的光催化降解

圖 6(a)模擬了MGO/TiO2-aptamer光催化降解 AFB1的動力學行為。結果表明,3種初始質量濃度條件下AFB1標準溶液的ln(C0/C) 與反應時間t存在良好的線性關系(R2≥0.98),MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的過程符合一級動力學反應規律,且AFB1標準溶液的降解速率隨著初始質量濃度的增加從0.033 9 min-1降低至0.006 5 min-1,可能是因為MGO/TiO2-aptamer的用量不變時,其活性位點總量和表面積是不變的,若毒素含量提高,反應過程中產生的更多中間產物會附著在光催化劑晶體表面,光催化劑的處理負荷也就越大從而影響對AFB1的捕捉,導致降解速率減小。同時,由圖6(b)可以看出,通過適配體功能化后的材料降解速率由0.012 9 min-1提高至0.033 9 min-1,提高約2.6倍,再次驗證了適配體功能化MGO/TiO2對于AFB1的降解增強效果。

圖6 不同初始質量濃度 AFB1 及不同材料光催化降解動力學模型

3 結論

利用核酸適配體對磁性氧化石墨烯復合二氧化鈦光催化材料進行選擇性修飾,成功合成光催化復合材料MGO/TiO2-aptamer。使用SEM、TEM以及FTIR對兩種光催化劑進行表征,結果表明TiO2與Fe3O4顆粒相對均勻地附著在MGO片層表面,核酸適配體對于MGO/TiO2的功能化過程并沒有破壞其表面微觀結構,且適配體的骨架、堿基以及CO—NH鍵特征峰均在FTIR中表現明顯,通過TEM 元素映射圖譜可以發現Ti、Fe元素以及核酸適配體特有的N、P元素,證明MGO/TiO2-aptamer制備成功。與未修飾的 MGO/TiO2材料相比,MGO/TiO2-aptamer對低質量濃度AFB1和混合毒素中AFB1的降解率顯著提高,驗證了其對低質量濃度毒素的降解增強效果以及選擇性降解性能。在優化條件下,當MGO/TiO2-aptamer添加量6 mg,在pH 3的環境中使用紫外可見光照射120 min后,AFB1降解率可達98.3%,且AFB1的光催化降解遵循 Langmuir-Hinshelwood 準一級動力學模型。本研究為制造選擇性降解食品中AFB1的光催化材料提供了新思路,后續需進一步研究光催化過程的降解作用機制、主要活性物質以及材料重復使用效果。