真空冷藏條件下羅非魚內源蛋白酶對魚片質構劣化的作用

范銘良 郝淑賢 李來好 陳勝軍 岑劍偉 吳燕燕 魏涯 相歡 黃卉

摘要：【目的】探究冷藏期間造成羅非魚魚肉質構品質劣化的關鍵蛋白酶，為提升冷藏魚肉品質提供理論依據。【方法】對羅非魚魚片進行真空包裝，于4 ℃下冷藏，在0～6 d內對魚肉進行質構、pH、肌原纖維小片化指數（MFI）、內源蛋白酶活性及在不同細胞器的分布和肌原纖維SDS-PAGE圖譜測定，并通過皮爾遜相關分析確定冷藏期間造成魚肉質構劣化的關鍵蛋白酶。【結果】冷藏過程中，羅非魚魚肉pH呈先降低后升高的變化趨勢，最終pH為6.68；硬度和MFI分別呈下降和升高的趨勢；組織蛋白酶B+L活性變化整體表現為升高趨勢，第6 d時活性為初始值的1.27倍，在肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中活性呈先上升后下降的變化趨勢，在溶酶體中活性呈下降趨勢；組織蛋白酶B、D活性變化整體表現為先升高后降低，且均在第4 d達最大值，分別為初始值的1.20和1.48倍，肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B活性呈先升高后降低的變化趨勢，溶酶體中的組織蛋白酶B活性呈下降趨勢，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶D活性呈升高趨勢，溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性呈降低趨勢；鈣離子濃度呈升高趨勢，鈣激活蛋白酶活性呈先升高后降低的變化趨勢；肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜中肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和肌球蛋白輕鏈的條帶逐漸減少和模糊；組織蛋白酶B、B+L活性與魚肉硬度呈極顯著負相關（P<0.01，下同），與魚肉MFI呈極顯著正相關；組織蛋白酶D和鈣激活蛋白酶活性與魚肉硬度和MFI無顯著相關性（P>0.05）。【結論】組織蛋白酶B和組織蛋白酶L參與肌原纖維蛋白的降解和線粒體介導的細胞凋亡，可能是冷藏期間羅非魚魚肉質構劣化的2個關鍵靶點酶，可采取有效技術手段對其活性進行抑制，進而提升貯藏期間魚肉質構品質。

關鍵詞：內源蛋白酶；質構品質；魚肉貯藏；肌原纖維蛋白；羅非魚魚片

中圖分類號：S986.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）02-0555-09

Abstract：【Objective】 To investigate key proteases that caused deterioration of tilapia meat texture quality during refrigeration， and to provide a theoretical basis for refrigerated fish meat quality improvement. 【Method】Tilapia fillets were vacuum-packed and refrigerated at 4 ℃，and texture，pH，myofibril fragmentation index （MFI），endogenous protease activity， endogenous protease distribution in organelles and myofibril SDS-PAGE profiles were determined during 0-6 d. Key proteases that caused the deterioration of fish meat texture during refrigeration were identified through Pearson correlation analysis. 【Result】pH of tilapia fish meat decreased and then increased during refrigeration，with a final pH of 6.68； hardness decreased but MFI increased； cathepsin B+L activity increased overall as it was 1.27 times of its initial value on 6 d， and it first increased and then decreased in myofibril， myogen and mitochondria but it decreased in lysosome； cathepsin B activity and cathepsin D activity increased and then decreased， and they both reached the maximum on 4 d， which were 1.20 times and 1.48 times of their initial values， respectively. Cathepsin B activity in myofibril， myogen and mitochondria first increased and then decreased but it decreased in lysosome； cathepsin D activity increased in myofibril and myogen， but it decreased in lysosome and mitochondria； calcium ion concentration increased and calcium-activated protease activity first increased and then decreased； myofibrillar protein SDS-PAGE profile showed that bands of myosin heavy chain， actin， and myosin light chain became less and blurred； cathepsin B activity and cathepsin B+L activity had an extremely negative correlation with fish meat hardness（P<0.01，the same below）， and they also had an extremely negative correlation with MFI of fish meat； cathepsin D activity and calcium-activated protease activity were not significantly correlated with fish meat hardness or MFI（P>0.05）. 【Conclusion】Cathepsin B and cathepsin L participate in myofibrillar protein degradation and mitochondria-mediated apoptosis， and such situation may be attributed to the two key target enzymes for tilapia meat deterioration during refrigeration. Available techniques can be taken to inhibit their activity to improve fish meat texture quality during storage.

Key words： endogenous protease； texture quality； fish meat storage； myofibrillar protein； tilapia fillet

Foundation items：National Special Freshwater Fish Industry Technology System Project（CARS-46）；Fundamental Research Funds for Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD69）；Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences（2021SD06）

0 引言

【研究意義】羅非魚（Oreochromis niloticus）含有豐富的氨基酸，是一種高蛋白的經濟魚類（熊雅雯等，2022）。我國是羅非魚生產大國，2020年羅非魚養殖產量達165.54萬t，占淡水魚總產量的6.4%（農業農村部漁業漁政管理局等，2021），具有極好的發展前景。隨著羅非魚市場的擴大，消費者對魚肉的品質要求更高，只需通過簡單的觸碰就能判斷魚肉的硬度，但魚肉在運輸和貯藏期間軟化現象十分嚴重，影響羅非魚消費市場。因此，明確羅非魚在冷藏過程中魚肉軟化的潛在靶點，對于提高羅非魚在貯藏儲運期間質構品質具有重要意義。【前人研究進展】魚肉的質地是消費者判斷其新鮮的重要指標，魚肉在貯藏期間質地品質劣化十分嚴重。Bao等（2020）發現青魚（Mylopharyngodon piceus）在冷藏過程中隨著肌鈣蛋白、肌球蛋白和肌動蛋白的降解，肌纖維與肌原纖維出現縫隙，可能是魚肉在貯藏過程中品質下降的一個原因。Tang等（2020）研究鱖魚（Siniperca chuatsi）死后貯藏結構蛋白與肌肉品質的關系，發現結構蛋白被降解會影響肌原纖維的完整性，從而影響肌肉品質。Zhou等（2020）研究河豚魚（Takifugu obscurus）肌肉品質與貯藏溫度的關系，發現在0 ℃時魚肉的肌原纖維完整性最好；肌原纖維的完整性越好，魚肉的肌肉品質就越好。貯藏期間魚肉質地劣化是迫切需要解決的問題，近年來，內源蛋白酶在魚肉質地劣化中的作用受到關注，目前認為涉及到肌原纖維等蛋白降解主要是鈣激活蛋白酶系統和組織蛋白酶系統進行的（Zhang and Xie，2020）。鈣激活蛋白酶是鈣依賴型的細胞內中性半胱氨酸蛋白酶，其活性與鈣離子濃度相關（孫蕾蕾等，2014）。Chéret等（2007）研究內源蛋白酶與對舌齒鱸（Dicentrarchus labrax L.）魚肉肌原纖維蛋白降解的關系，發現鈣激活蛋白酶系統對海鱸魚肌原纖維蛋白降解過程是次要作用。組織蛋白酶中能引起肌原纖維降解，導致魚肉品質劣化的主要是組織蛋白酶B、D和L。Nielsen和Nielsen（2001）在鯡魚（Clupea harengus）中發現組織蛋白酶D能降解肌球蛋白重鏈。Ladrat等（2003）在研究海鱸魚蛋白水解中發現組織蛋白酶L能降解魚肉中的肌球蛋白和肌動蛋白，且能與組織蛋白酶B同時降解肌球蛋白重鏈。Godiksen等（2009）在研究虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）肌肉蛋白降解中發現組織蛋白酶B、D和L能對肌肉蛋白進行降解，且組織蛋白酶D對魚肉硬度影響明顯。Lomiwes等（2014）發現在低pH情況下，組織蛋白酶B活性越高，肌間線蛋白降解越快，肌間線蛋白降解會導致肌原纖維束解離。【本研究切入點】雖然已有一些對內源性蛋白酶和魚肉軟化的研究，但有關羅非魚鮮見報道，不同的魚類因品種和生長環境不同，魚肉內源蛋白酶與肌肉蛋白也不相同，且負責質地軟化的每種組織蛋白酶的相對作用有所不同（Godiksen et al.，2009；Wang et al.，2009；Ahmed et al.，2013）。此外，關于內源性蛋白酶及組織蛋白酶亞細胞再分布在羅非魚冷藏儲存期間魚片質地變化中的作用，目前發表的信息有限。【擬解決的關鍵問題】以尼羅羅非魚魚片為試驗材料，研究羅非魚魚肉真空包裝在4 ℃條件下冷藏0～6 d內質構變化、鈣離子濃度變化、鈣激活蛋白酶活性變化、肌原纖維蛋白降解程度、組織蛋白酶活性變化及其亞細胞再分布，并確定在冷藏期間羅非魚魚肉軟化的靶點，為提升冷藏期間羅非魚魚肉質構品質提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

尼羅羅非魚購自廣州市華潤萬家超市，質量為800±50 g/條。Fura-2 AM、BeyoColorTM彩色預染蛋白、5×SDS-PAGE上樣緩沖液和考馬斯亮藍染色液購自上海碧云天生物技術有限公司；Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC和N-Suc-Leu-Tyr-AMC購自美國Sigma公司；NuPAGETM Bis-Tris預制膠（12%）和NuPAGETM MOPS SDS電泳緩沖液（20×）購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自廣州領馭生物科技有限公司。主要儀器設備：3K30型臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）、Sunrise-basic Tacan吸光酶標儀（瑞士TECAN公司）、Mini Gel Tank蛋白電泳槽（美國Invitrogen公司）、CT3質構儀（美國Brookfield公司）、Image Scanner III凝膠成像掃描儀（美國GE公司）和Cary Eclipse熒光分光光度計（美國VARIAN公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 羅非魚樣品處理 將8條鮮活的羅非魚敲擊致死，將背部新鮮白肉切成2 cm×2 cm×1 cm的塊狀，共46個樣品，對樣品真空包裝并進行4 ℃冷藏。

1. 2. 2 魚肉質構測定 參考黃卉等（2018）的方法稍作修改，取羅非魚魚片2條對角線上的6個點進行測定，設置測試速度為30 mm/min，下壓縮距離0.3 cm，記錄測定的硬度值。

1. 2. 3 魚肉pH測定 參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》進行測定。

1. 2. 4 肌原纖維小片化指數（Myofibril fragmentation index，MFI）測定 參考張詩泉等（2022）的方法稍作修改，取2 g魚肉與30 mL緩沖液（25 mmo/L磷酸鹽緩沖液、100 mmol/L KCI、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2，pH 7.0）在冰水中均質30 s，間隔20 s后再均質30 s，用紗布過濾，將混合液離心15 min（4 ℃，10000×g），將沉淀再溶于緩沖液中，轉速離心15 min（4 ℃，10000×g），將所得沉淀懸于緩沖液中，將樣品蛋白濃度稀釋為0.5 mg/mL，將540 nm處測得的吸光值乘以200即為MFI。

1. 2. 5 肌原纖維蛋白提取 參考李銳等（2020）的方法稍作修改，稱取2 g羅非魚碎肉，加入10 mL Tris-HCl緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl、1mmol/L PMSF，pH 7.2），均質30 s，間隔20 s后再均質30 s，均質后離心15 min（4 ℃，10000×g），加入20 mL鹽溶液（0.06 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L PMSF，pH 7.2）溶解沉淀后均質1 min，溫度保持在4 ℃左右，靜置30 min后離心15 min（4 ℃，10000×g），上清液即為肌原纖維蛋白。

1. 2. 6 肌原纖維蛋白變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考李銳等（2020）的方法稍作修改，上清液與上樣緩沖液混合，體積比為3∶2，在沸水中放置3 min，得到電泳樣品。電泳電壓設為100 V，染色1 h，脫色1 h，染色劑為考馬斯亮藍R250，脫色液由10%醋酸、40%乙醇和50%水組成。

1. 2. 7 亞細胞結構分離 羅非魚肌原纖維和溶酶體分級與提取參考Ge等（2015）的方法，取3 g魚肉在15 mL緩沖液中（100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L Na4P2O7、1 mmol/L Na2EDTA，pH 7.2）均質1 min，用紗布過濾后離心10 min（4 ℃，1100×g），將沉淀懸于緩沖液中即為肌原纖維部分，將剩余的上清液離心（4 ℃，3000×g）10 min，此時的沉淀為線粒體部分，將上清液繼續離心30 min（4 ℃，16000×g），沉淀為溶酶體部分，上清液為肌漿。

1. 2. 8 鈣離子濃度測定 參考Thompson等（2020）的方法稍有修改，取3 g絞碎的魚肉與30 mL預冷緩沖液（118 mmol/L NaCl、4 mmol/L KCl、66 mmol/L MgCl2、330 mmol/L HEPES、5 mmol/L NaH2PO4、5 mmol/L葡萄糖）混合，混勻后離心15 min（4 ℃，5000×g），將上清液與1 μmol/L Fura-AM在室溫下靜置1 h，采用酶標儀測定混合液在發射波長510 nm、激發波長分別在340和380 nm的吸光值，340與380 nm處吸光值之比即為鈣離子濃度。

1. 2. 9 鈣激活蛋白酶和組織蛋白酶B、D、L的提取及活性測定 參考Xu等（2015）的方法，取10 g魚肉加入20 mL 20 mmol/L Tris溶液（pH 7.5），均質30 s，間隔20 s后再均質30 s，在4 ℃下不時攪拌30 min，隨后離心20 min（4 ℃，16000×g），上清液即為粗酶提取液。組織蛋白酶B和L特異性熒光底物分別為Z-Arg-Arg-AMC和Z-Phe-Arg-AMC，鈣激活蛋白酶反應底物為N-Suc-Leu-Tyr-AMC，底物濃度均為20 μmol/L。取粗酶液0.5 mL，與0.25 mL反應緩沖液（組織蛋白酶B：352 mmol/L KH2PO4、48 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L Na2EDTA，pH 6.0，使用前配制成含8 mmol/L L-Cys的新鮮溶液；組織蛋白酶L：340 mmol/L NaAc、60 mmol/L HAc、4 mmol/L Na2EDTA，pH 5.5，使用前配制成含8 mmol/L DTT的新鮮溶液；鈣激活蛋白酶：150 mmol/L Tris-HCl、7.5 mmol/L CaCl2，pH 6.0）混合，在37 ℃恒溫箱中預熱10 min，加入對應的反應底物，反應30 min后加入2.5 mL終止液（50 mmol/L Tris-HCl、1% SDS，pH 7.0）。采用熒光分光光度計測定7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的釋放量。測定條件為激發波長340 nm、發射波長440 nm。酶活力單位定義為1 min內釋放出1 μmol/L AMC所需的酶量。

組織蛋白酶D的提取與活性測定（李來好等，2015）：稱取15 g碎魚肉，加入10倍體積的預冷丙酮，均質后用布氏漏斗過濾，濾液風干，得到丙酮粉，加入20 mL KCl溶液（2%），混勻后離心15 min（4 ℃，10000×g），所得上清液即為組織蛋白酶D粗酶液。取酶液與酸化的牛血紅蛋白反應，參考Lowry法測定釋放出的多肽，每個酶活力單位定義為1 min內釋放1 μmol/L Tyr所需的酶量。

1. 3 統計分析

采用SPSS 23.0和Origin 8.5處理試驗數據，并進行相關分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 羅非魚魚肉在冷藏期間pH、硬度和MFI的變化

魚肉貯藏過程中pH變化能反映肌肉組織的生化變化，肌肉組織生理環境的改變會影響肌肉品質，因此pH是衡量魚肉品質的重要指標。由表1可知，真空冷藏0～3 d，羅非魚魚肉pH顯著降低（P<0.05，下同），在3～4 d pH略有升高，在5～6 d pH無顯著變化（P>0.05，下同），最終pH為6.68。

魚肉硬度是反映魚肉質構品質的重要指標，也是消費者判斷魚肉新鮮度的一種方式。如表1所示，在真空冷藏條件下，羅非魚魚肉在0～5 d內硬度顯著降低，在5～6 d硬度無顯著變化，最終魚肉硬度較初始值下降59.05%。

MFI能反映肌原纖維結構和肌原纖維蛋白的完整性。如表1所示，在冷藏期間，羅非魚魚肉MFI在0～6 d內顯著增加，最終值為初始值的2.44倍。

2. 2 冷藏期間羅非魚魚肉中組織蛋白酶B、B+L和D的活性變化

羅非魚在貯藏過程中質地品質劣化主要由內源蛋白酶對肌原纖維的降解導致，為進一步明確魚肉質地劣化的重要蛋白酶，對魚肉貯藏過程中內源蛋白酶的活性進行考察。如圖1所示，在整個冷藏期間，組織蛋白酶B+L活性變化整體為升高趨勢，在第6 d時活性為初始值的1.27倍；組織蛋白酶B和D活性變化整體為先升高后降低，且均在第4 d達最大值，分別為初始值的1.20和1.48倍，第6 d時組織蛋白酶D活性為初始值的1.56倍。

2. 3 冷藏過程中羅非魚魚肉中組織蛋白酶B、B+L、D活性及分布變化

魚體死后，肌肉細胞中的組織蛋白酶從溶酶體中釋放后，會發揮其蛋白水解作用。如圖2所示，冷藏期間魚肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B活性整體變化為先升高后下降，分別在第1、2和1 d達最大值，此時活性分別為初始值的1.02、1.10和1.55倍，之后隨貯藏時間延長活性下降，第6 d時，活性分別為初始值的70%、89%和1.15倍；在溶酶體中組織蛋白酶B活性呈下降趨勢，第6 d活性降低11.75%。冷藏期間魚肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶B+L活性呈先升高后降低的變化趨勢，且均在第2 d達最大值，活性分別為初始值的1.27、1.61和1.11倍，之后隨著貯藏時間延長活性下降，第6 d時活性分別為初始值的1.20倍、1.28倍和98%；在溶酶體中組織蛋白酶B+L活性呈下降趨勢，貯藏至第6 d時活性降低10.00%（圖3）。由圖4可知，冷藏期間魚肉肌原纖維、肌漿蛋白和線粒體中的組織蛋白酶D活性變化與組織蛋白酶B、L不同，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶D活性在冷藏期間呈持續上升趨勢，第6 d時活性分別為初始值的2.18和1.75倍；而溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性在冷藏期間呈下降趨勢，在第6 d時活性分別降低54.94%和95.79%。

2. 4 冷藏期間羅非魚魚肉肌漿中鈣離子濃度和鈣激活蛋白酶活性變化

由圖5可知，在0～1 d羅非魚魚肉鈣激活蛋白酶活性顯著增加，提升43.00%，魚肉肌漿中鈣離子濃度在0～1 d內也顯著增加（圖6），但隨著冷藏時間的延長鈣激活蛋白酶活性降低，最終活性接近于初始值。而鈣離子濃度在0～4 d內顯著增加，在4～6 d內無顯著變化，最終值為初始值的1.36倍。

2. 5 羅非魚貯藏過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE作用

由圖7可知，冷藏6 d的羅非魚魚肉肌原纖維蛋白相對分子質量為17～220 kD；其中，肌球蛋白重鏈（Myosinheavychain，MHC）（相對分子質量220 kD）、肌動蛋白（Actin）（相對分子質量45 kD）和肌球蛋白輕鏈（Myosinlightchain，MLC）（相對分子質量17～20 kD）條帶相對清晰。在0～6 d內，隨著貯藏時間的延長，MHC、肌動蛋白和MLC的條帶逐漸減少和模糊，反映了在貯藏過程中羅非魚魚肉肌原纖維蛋白降解情況。

2. 6 魚肉內源蛋白酶活性與魚肉硬度和MFI的相關分析結果

對冷藏過程中羅非魚魚肉中的內源蛋白酶活性與魚肉硬度和MFI進行皮爾遜相關分析，結果如表2所示，冷藏過程中羅非魚魚肉中組織蛋白酶B、B+L活性與魚肉硬度呈極顯著負相關（P<0.01，下同），與魚肉MFI呈極顯著正相關；組織蛋白酶D和鈣激活蛋白酶活性與魚肉硬度和MFI無顯著相關性。

3 討論

3. 1 冷藏過程中羅非魚魚肉理化指標的變化

魚肉硬度和MFI作為反映魚肉質量和組織特征的重要指標，由于魚肉汁液流失、蛋白質降解和變性氧化等而導致魚肉組織有不同程度的硬度變化，而MFI能反映肌原纖維的完整性。因此，硬度和MFI在魚肉及其產品的科學研究和產品開發中具有重要意義。郝子娜等（2022）對4 ℃下的草魚（Ctenopharyngodon idella）魚肉在0～9 d內品質變化進行研究，發現隨冷藏時間的延長魚肉硬度不斷下降。陳曉楠等（2022）發現凍藏的海鰻魚（Muraenesox cinereus）魚肉在0～120 d內MFI隨貯藏時間的延長呈持續升高趨勢。本研究中，隨著貯藏時間的延長，羅非魚魚肉中的肌原纖維蛋白在內源蛋白酶的作用下被持續降解，造成魚肉硬度的下降和MFI的升高。在魚肉貯藏期間，活性蛋白酶引起的蛋白質三維結構分解是造成魚肉質構劣化的主要原因，且在貯藏前期發揮的作用遠高于微生物（Zhang and Xie，2020）。

pH是衡量魚肉品質的重要指標之一。羅非魚被宰殺后，由于厭氧呼吸過程中生成的乳酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）被降解生成磷酸，導致魚肉pH下降，而后隨著貯藏時間的延長蛋白質被降解，生成的堿性胺類物質導致魚肉pH上升。官緣等（2022）研究發現海鱸魚魚肉在冷藏0～10 d內pH變化為先下降后升高，本研究在冷藏期間羅非魚魚肉pH變化也為先下降后升高，與官緣等（2022）的研究結果一致。

3. 2 冷藏過程中羅非魚魚肉組織蛋白酶B、B+L和D在不同細胞器的分布

有研究報道證實在魚肉貯藏期間，組織蛋白酶B、D和L是造成魚肉軟化的主要原因（Godiksen et al.，2009）。組織蛋白酶主要存在于溶酶體中，與底物無法接觸，因此在活魚體內通常為無活性狀態；而魚死后的冷藏過程中，鈣離子濃度增加和pH降低導致溶酶體破壞，使得組織蛋白酶釋放，對魚肉肌細胞中的蛋白質產生降解作用（魏世娜和秦啟偉，2018）。對魚肉中不同細胞器含有的組織蛋白酶B、D和B+L活性進行綜合分析，旨在闡明組織蛋白酶B、D和L在羅非魚魚肉貯藏期間質量變化中的作用。羅非魚魚肉在冷藏期間由于pH降低和鈣離子濃度增加導致溶酶體膜破裂，本研究中，在羅非魚魚肉冷藏期間溶酶體中的組織蛋白酶B、B+L和D活性均下降。Bahuaud等（2008）發現大西洋鮭魚（Salmo salar L.）在-1.5和-25 ℃下溶酶體中組織蛋白酶B和B+L活性下降。Ge等（2015）發現草魚魚肉在微凍條件下貯藏期間溶酶體中的組織蛋白酶B、B+L和D活性均下降。魚被宰殺后，肌肉中組織蛋白酶被溶酶體釋放后發揮其降解蛋白質的作用，這些蛋白酶還通過水解Bid及抗凋亡蛋白來參與線粒體介導的細胞凋亡，間接影響肌肉蛋白質的降解（Guicciardi et al.，2004；?esen et al.，2012）。因此，線粒體中組織蛋白酶B、L活性的增加，表明組織蛋白酶B、L參與了細胞凋亡過程。本研究中，肌原纖維和肌漿蛋白中的組織蛋白酶B和B+L活性在0～1 d均為增加，而后隨著冷藏時間的延長活性降低，說明在貯藏1 d后組織蛋白酶B和B+L可能已開始水解肌原纖維和肌漿中的某些蛋白，且水解速度大于酶釋放至肌原纖維中的速度，與Ge等（2015）的研究結論相似。研究發現組織蛋白酶D不僅存在于溶酶體中，線粒體中也有一部分（Minarowska et al.，2009）。因此在羅非魚魚肉冷藏過程中，溶酶體和線粒體中的組織蛋白酶D活性持續下降，對應肌漿蛋白和肌原纖維中活性上升。

綜上，組織蛋白酶B、B+L和D活性在不同細胞器中有顯著變化，其參與了肌原纖維和肌漿中某些蛋白的降解及線粒體介導的細胞凋亡，揭示了組織蛋白酶B、D、L在羅非魚魚片品質劣化中的作用。

3. 3 冷藏過程中鈣激活蛋白酶和鈣離子濃度的關系

鈣激活蛋白酶為中性半胱氨酸酶，鈣蛋白酶能破壞Z線，其損壞會使肌原纖維分解斷裂。鈣激活蛋白酶在不同鈣離子濃度下會表現不一樣的特性，一般而言，細胞內鈣離子濃度越高，鈣激活蛋白酶的活性就越高（時海波等，2020）。魚體死后內質網中的鈣離子大量釋放至肌漿中，能激活鈣激活蛋白酶。本研究中，鈣激活蛋白酶活性只在0～1 d內隨鈣離子濃度增加而升高，在1～6 d內鈣激活蛋白酶活性降低，可能是由于其本身的自溶作用及鈣蛋白酶抑素發揮作用（孫蕾蕾等，2014）。對本研究冷藏期間魚肉肌漿中鈣離子濃度與鈣激活蛋白酶活性進行相關分析，結果顯示二者無顯著相關性（r=-0.275）。朱燕等（2007）研究鈣離子對離體肌束中鈣激活蛋白酶的影響，結果發現500 μmol/L以內的鈣離子處理肌束可提高肌束中部分鈣激活蛋白酶活性，當高于此濃度時，部分鈣激活蛋白酶因發生自動降解而失活。總體而言，鈣離子濃度的增加只能在冷藏初期激活鈣激活蛋白酶，隨著貯藏時間的延長鈣激活蛋白酶活性降低。

3. 4 冷藏過程中羅非魚魚肉中的鈣激活蛋白酶與組織蛋白酶B、B+L、D對魚肉質構的影響

貯藏期間魚肉質構品質的劣化與內源蛋白酶聯系緊密，發現對此過程貢獻較大的內源蛋白酶有利于為提升魚肉品質提供理論基礎。鈣激活蛋白酶在貯藏初期對魚肉質構劣化貢獻很大，Ahmed等（2015）、Chang等（2016）研究指出在水產品和畜肉貯藏期間，鈣激活蛋白酶在蛋白質水解過程中先對蛋白進行局部的特異性降解，再被溶酶體組織蛋白酶進一步降解。葛黎紅（2017）通過體外模擬內源蛋白酶對肌原纖維蛋白進行降解，發現鈣激活蛋白酶與組織蛋白酶B、L在降解肌原纖維蛋白過程中存在協同作用。

有研究表明貯藏過程中組織蛋白酶B、L對魚肉質構劣化貢獻較大（Ge et al.，2015）。此外，組織蛋白酶D被認為不是造成貯藏期內魚肉質構品質劣化相關的主要蛋白酶之一（Wang et al.，2009；Ahmed et al.，2013）。Ladrat等（2003）證實了組織蛋白酶B、L在體外對肌球蛋白、α-肌動蛋白和原肌球蛋白的強烈降解作用，并指出這是貯藏期間魚肉質構劣化的原因之一。Bahuaud等（2010a，2010b）發現擁擠應激條件下的大西洋鮭魚，組織蛋白酶B、L活性基因表達的增加與魚片質構劣化相關，表明魚肉質構劣化與組織蛋白酶B、L活性之間存在潛在的關系。本研究結果表明，組織蛋白酶B、L活性與魚肉硬度和MFI具有極顯著相關性，說明在羅非魚魚肉整個貯藏期間組織蛋白酶B、L對魚肉質構劣化過程發揮重要作用。

3. 5 冷藏過程中羅非魚魚肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化

肌原纖維蛋白被降解情況通過SDS-PAGE圖譜蛋白條帶的模糊、弱化和消失能直觀體現。肌原纖維蛋白是由肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白等組成的復合體，新鮮羅非魚片肌原纖維蛋白條帶主要為MHC、肌動蛋白和MLC。Jasra等（2001）發現野鯪魚（Labeo rohita）在冷藏期間MLC發生明顯的降解。Wang等（2009）對冷藏期間大西洋鱈魚（Gadus morhua L.）品質進行研究，結果發現魚肉在冷藏7和9 d后MHC出現不同程度的降解。沈妮等（2019）發現在0和4 ℃下冷藏的帶魚肌動蛋白條帶隨貯藏時間的延長而逐漸減少。本研究中，MHC、肌動蛋白和MLC條帶隨冷藏時間延長而減少，說明冷藏期間肌原纖維蛋白被降解程度較大，與前人研究結果（Jasra et al.，2001；Wang et al.，2009；沈妮等，2019）相似。MHC條帶在第1、2 d發生明顯的弱化，在對應的時間內魚肉肌原纖維中的組織蛋白酶B、L活性達最大值。在3～6 d內MHC和肌動蛋白條帶無明顯變化，但此時肌原纖維中的組織蛋白酶D活性呈升高趨勢，而組織蛋白酶B、L活性呈下降趨勢，表明組織蛋白酶B、L較組織蛋白酶D在肌原纖維蛋白水解方面發揮更大的作用。可能原因是組織蛋白酶D能水解的肌原纖維蛋白種類較組織蛋白酶B、L少，也可能是冷藏過程中某一段時期的pH與組織蛋白酶D能直接降解完整的蛋白且其與最適pH相同，但這段時期內組織蛋白酶D的特異性底物不存在。

4 結論

冷藏期間羅非魚魚肉組織蛋白酶B、L在魚肉質構劣化過程中發揮較大作用，參與肌原纖維蛋白的降解和線粒體介導的細胞凋亡；鈣離子濃度的增加只能在冷藏初期激活鈣激活蛋白酶，隨著貯藏時間的延長鈣激活蛋白酶活性降低。因此，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L可能是冷藏期間羅非魚魚肉質構劣化的2個關鍵靶點酶，可采取有效技術手段對其活性進行抑制，進而提升貯藏期間魚肉質構品質。

參考文獻：

陳曉楠，蔣慧麗，吳瓊靜，涂傳海，張賓. 2022. 穩定態二氧化氯結合真空包裝對凍藏海鰻品質特性的影響［J］. 食品工業科技，43（7）：255-261. ［Chen X N，Jiang H L，Wu Q J，Tu C H，Zhang B. 2022. Effect of stable chlorine dio-xide combined with vacuum packaging on the quality of pike eel（Muraenesox cinereus） during frozen storage［J］. Science and Technology of Food Industry，43（7）：255-261.］ doi：10.13386/j.issn1002-0306.2021080333.

葛黎紅. 2017. 內源蛋白酶在低溫保鮮草魚質構劣化中的作用與控制研究［D］. 無錫：江南大學. ［Ge L H. 2017. Study on correlation of endogenous proteases with texture deterioration of grass carp （Ctenopharyngodon idella） during chilled storage and quality control［D］. Wuxi：Jiangnan University.］

官緣，藍蔚青，孫雨晴，劉琳，周大鵬，謝晶. 2022. 超聲—咖啡酸聯合處理對海鱸魚冷藏期間品質變化的影響［J］. 食品科學，43（9）：207-214. ［Guan Y，Lan W Q，Sun Y Q，Liu L，Zhou D P，Xie J. 2022. Effect of ultrasonic treatment combined with caffeic acid on the quality of sea bass（Lateolabrax japonicas） during refrigerated storage［J］. Food Science，43（9）：207-214.］ doi：10.7506/spkx 1002-6630-20210219-206.

郝子娜，馮碩，趙凱，陳思宇，吉美然，常寶賢. 2022. 茶多酚—海藻酸鈉涂膜處理對草魚儲藏品質的影響［J］. 保鮮與加工，22（7）：31-36. ［Hao Z N，Feng S，Zhao K，Chen S Y，Ji M R，Chang B X. 2022. Effects of tea polyphenol-sodium alginate coating on grass carp quality during sto-rage［J］. Storage and Process，22（7）：31-36.］ doi：10. 3969/j.issn.1009-6221.2022.07.005.

黃卉，鄭陸紅，李來好，楊賢慶，魏涯，翟紅蕾，吳燕燕，張鷹，郝淑賢. 2018. 不同預冷溫度對鱸魚冰藏期間質構和色差的影響［J］. 食品工業科技，39（24）：302-308. ［Huang H，Zheng L H，Li L H，Yang X Q，Wei Y，Zhai H L，Wu Y Y，Zhang Y，Hao S X. 2018. Effects of different precooling temperature on texture and color of Micropterus salmoides during ice storage［J］. Science and Technology of Food Industry，39（24）：302-308.］ doi：10.13386/j.issn 1002-0306.2018.24.051.

李來好，孫蕾蕾，黃卉，楊賢慶，郝淑賢，魏涯，馬海霞. 2015. 冰藏奧尼羅非魚片組織蛋白酶與品質變化的相關性分析［J］. 水產學報，39（4）：589-597. ［Li L H，Sun L L，Huang H，Yang X Q，Hao S X，Wei Y，Ma H X. 2015. Correlation analysis of cathepsins and quality variations of tilapia （Oreochromis niloticus [♂]×O. aureus ♀） fillets du-ring iced storage［J］. Journal of Fisheries of China，39（4）：589-597.］ doi：10.11964/jfc.20141109558.

李銳，孫祖莉，楊賢慶，李來好，魏涯，岑劍偉，相悅，趙永強. 2020. 加熱方式對羅非魚片質構特性和蛋白質理化特性的影響［J］. 大連海洋大學學報，35（4）：577-583. ［Li R，Sun Z L，Yang X Q，Li L H，Wei Y，Cen J W，Xiang Y，Zhao Y Q. 2020. Effects of heating methods on texture and protein physicochemical properties of Nile tilapia fillets［J］. Journal of Dalian Fisheries University，35（4）：577-583.］ doi：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2020-040.

農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會. 2021. 中國漁業統計年鑒［M］. 北京：中國農業出版社：24-25. ［Fishery and Fishery Administration of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs，National Aquatic Technology Promotion Station，China Society of Fisheries. 2021. China fishery statistical yearbook［M］. Beijing：China Agricultural Press：24-25.］

沈妮，吳甜甜，李苑，江楊陽，陳士國，胡亞芹. 2019. 低溫冷藏對帶魚肌肉蛋白的影響［J］. 漁業科學進展，40（6）：196-202. ［Shen N，Wu T T，Li Y，Jiang Y Y，Chen S G，Hu Y Q. 2019. Effect of chilling storage on the muscle protein of hairtail［J］. Progress in Fishery Sciences，40（6）：196-202.］ doi：10.19663/j.issn2095-9869.20180818002.

時海波，諸永志，方芮，張新笑，鄒燁，王道營，徐為民. 2020. 宰后肉品嫩化技術及其作用機理研究進展［J］. 食品科學，41（23）：311-321. ［Shi H B，Zhu Y Z，Fang R，Zhang X X，Zou Y，Wang D Y，Xu W M. 2020. Recent progress in post-mortem meat tenderization techniques and their mechanisms of action［J］. Food Science，41（23）：311-321.］ doi：10.7506/spkx1002-6630-20191106-075.

孫蕾蕾，黃卉，李來好，楊賢慶，郝淑賢，岑劍偉，楊少玲，趙永強. 2014. 影響宰后魚肉能量代謝和質構的酶及其活性測定方法研究進展［J］. 食品科學，35（11）：348-355. ［Sun L L，Huang H，Li L H，Yang X Q，Hao S X，Cen J W，Yang S L，Zhao Y Q. 2014. Enzymes associated with postmortem energy metabolism and texture of fish muscle and assays to detect them［J］. Food Science，35（11）：348-355.］ doi：10.7506/spkx1002-6630-201411067.

魏世娜，秦啟偉. 2018. 魚類溶菌酶和組織蛋白酶研究進展［J］. 廣西科學，25（1）：32-35. ［Wei S N，Qin Q W. 2018. Advance on lysozyme and cathepsin of fish［J］. Guangxi Science，25（1）：32-35.］ doi：10.13656/j.cnki.gxkx.2018 0206.002.

熊雅雯，黃卉，李來好，楊賢慶，陳勝軍，郝淑賢，吳燕燕，魏涯. 2022. 不同煮制條件對羅非魚片品質的影響［J］. 食品科學，43（11）：39-48. ［Xiong Y W，Huang H，Li L H，Yang X Q，Chen S J，Hao S X，Wu Y Y，Wei Y. 2022. Effects of different boiling conditions on the quality of tilapia fillets［J］. Food Science，43（11）：39-48.］ doi：10. 7506/spkx1002-6630-20210610-133.

張詩泉，劉永峰，葛鑫禹，張朵朵，侯晨梓. 2022. 鴨肉宰后成熟過程中食用品質、營養品質及嫩度變化研究［J/OL］. 食品與發酵工業. ［Zhang S Q，Liu Y F，Ge X Y，Zhang D D，Hou C Z. 2022. Study on the changes of edible quality，nutritional quality and tenderness during post-slaughter maturation of duck meat［J/OL］. Food and Fermentation Industries.］ doi：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032891.

朱燕，徐幸蓮，羅欣，周光宏. 2007. 鈣離子對鈣激活蛋白酶mRNA表達、活性及其對肌肉蛋白降解的影響［J］. 食品科學，28（5）：25-28. ［Zhu Y，Xu X L，Luo X，Zhou G H. 2007. Effects of calcium ion on calpains mRNA expression，activity and degradation of muscle protein［J］. Food Science，28（5）：25-28.］ doi：10.3321/j.issn：1002-6630. 2007.05.001.

Ahmed Z，Donkor O，Street W，VasiljevicT. 2013. Proteolytic activities in fillets of selected underutilized Australian fish species［J］. Food Chemistry，140（1-2）：238-244. doi：10.1016/j.foodchem.2013.02.042.

Ahmed Z，Donkor O，Street WA，Vasiljevic T. 2015. Calpains-and cathepsins-induced myofibrillar changes in post-mortem fish：Impact on structural softening and release of bioactive peptides［J］. Trends in Food Science & Techno-logy，45（1）：130-146. doi：10.1016/j.tifs.2015.04.002.

Bahuaud D，Gaarder M，Veiseth-Kent E，Thomassen M. 2010a. Fillet texture and protease activities in different families of farmed Atlantic salmon（Salmo salar L.）［J］. Aquaculture，310（1-2）：213-220. doi：10.1016/j.aquaculture.2010.10.008.

Bahuaud D，M?rk?re T，Langsrud O，Sinnes K，Veiseth E，Ofstad R，Thomassen M S. 2008. Effects of -1.5 ℃ super-chi-lling on quality of Atlantic salmon（Salmo salar） pre-rigor fillets：Cathepsin activity，muscle histology，texture and liquid leakage［J］. Food Chemistry，111（2）：329-339. doi：10.1016/j.foodchem.2008.03.075.

Bahuaud D，M?rk?re T，?stbye T K，Veiseth-Kent E，Thomassen M S，Ofstad R. 2010b. Muscle structure responses and lysosomal cathepsins B and L in farmed Atlantic salmon （Salmo salar L.） pre- and post-rigor fillets exposed to short and long-term crowding stress［J］. Food Chemistry，118（3）：602-615. doi：10.1016/j.foodchem. 2009.05.028.

Bao Y L，Wang K Y，Yang H X，Regenstein J M，Ertbjerg P，Zhou P. 2020. Protein degradation of black carp （Mylopharyngodon piceus） muscle during cold storage［J］. Food Chemistry，308：125576.doi：10.1016/j.foodchem. 2019.125576.

[ǒ] [C]esen M H，Pegan K，Spes A，Turk B. 2012. Lysosomal pathways to cell death and their therapeutic applications［J］. Experimental Cell Research，318（11）：1245-1251. doi：10. 1016/j.yexcr.2012.03.005.

Chang Y S，Hsu D H，Stromer M H，Chou R G R. 2016. Postmortem calpain changes in ostrich skeletal muscle［J］. Meat Science，117（2）：117-121. doi：10.1016/j.meatsci. 2016.03.004.

Chéret R，Delbarre-LadratC，de Lamballerie-Anton M，Verrez-Bagnis V. 2007. Calpain and cathepsin activities in post mortem fish and meat muscles［J］. Food Chemistry，101（4）：1474-1479. doi：10.1016/j.foodchem.2006.

Ge L H，Xu Y S，Xia W S. 2015. The function of endogenous cathepsin in quality deterioration of grass carp （Ctenopharyngodon idella） fillets stored in chilling conditions［J］. International Journal of Food Science & Technology，50（3）：797-803. doi：10.1111/ijfs.12713.

Godiksen H，Morzel M，Hyldig G，Jessen F. 2009. Contribution of cathepsins B，L and D to muscle protein profiles correlated with texture in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）［J］. Food Chemistry，113（4）：889-896. doi：10.1016/j.foodchem.2008.08.012.

Guicciardi M E，Leist M，Gores G J. 2004. Lysosomes in cell death［J］. Oncogene，23（16）：2881-2890. doi：10.1038/sj.onc.1207512.

Jasra S K，Jasra P K，Talesara C L. 2001. Myofibrillar protein degradation of carp（Labeo rohita （Hamilton）） muscle after post-mortem unfrozen and frozen storage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，81（5）：519-524. doi：10.1002/jsfa.841.

Ladrat C，Verrez-Bagnis V，No?l J，Fleurence J. 2003. In vitro proteolysis of myofibrillar and sarcoplasmic proteins of white muscle of sea bass （Dicentrarchus labrax L.）：Effects of cathepsins B，D and L［J］. Food Chemistry，81（4）：517-525. doi：10.1016/S0308-8146（02）00481-8.

Lomiwes D，Farouk M M，Wu G，Young O A. 2014. The deve-lopment of meat tenderness is likely to be compartmenta-lised by ultimate pH［J］. Meat Science，96（1）：646-651. doi：10.1016/j.meatsci.2013.08.022.

Minarowska A，Karwowska A，Gacko M. 2009. Quantitative determination and localization of cathepsin D and its inhibitors［J］. Folia Histochemica et Cytobiologica，47（2）：153-177. doi：10.2478/v10042-009-0073-4.

Nielsen L B，Nielsen H H. 2001. Purification and characterization of cathepsin D from herring muscle（Clupea harengus）［J］. Comparative biochemistry and Physiology B：Biochemistry & Molecular Biology，128（2）：351-363. doi：10.1016/S1096-4959（00）00332-8.

Tang M，Dai H J，Ma L，Yu Y，Liu T W，Feng X，Hu W J，Li Y，Zhang Y H. 2020. Degradation of structural proteins and their relationship with the quality of Mandarin fish（Siniperca chuatsi） during post-mortem storage and cooking［J］. International Journal of Food Science and Technology，55（4）：1617-1628. doi：10.1111/ijfs.14421.

Thompson M，Kliewer A，Maass D，Becker L，White D J，Brya-nt D，Arteaga G，Horton J，Giroir B P. 2000. Increased cardiomyocyte intracellular calcium during endotoxin-induced cardiac dysfunction in guinea pigs［J］. Pediatric Research，47（5）：669-676. doi：10.1203/00006450-20000 5000-00019.

Wang P A，Martinez I，Olsen R L. 2009. Myosin heavy chain degradation during post mortem storage of Atlantic cod （Gadus morhua L.）［J］. Food Chemistry，115（4）：1228-1233. doi：10.1016/j.foodchem.2009.01.031.

Xu Y S，Ge L H，Jiang X Q，Xia W S，Jiang Q X. 2015. Inhibitory effect of aqueous extract of Allium species on endogenous cathepsin activities and textural deterioration of ice-stored grass carp fillets［J］. Food and Bioprocess Technology，8（10）：2171-2175. doi：10.1111/ijfs.13047.

Zhang X C，Xie J. 2020. The differential effects of endogenous cathepsin and microorganisms on changes in the texture and flavor substances of grouper （Epinephelus coioides） fillets［J］. RSC Advances，10（18）：10764-10775. doi：10.1039/D0RA01028F.

Zhou R，Zheng Y R，Liu Y，Ma M. 2020. Texture and quality assessment of ready-to-eat farmed obscure puffer fish（Takifugu obscurus） fillet by evaluating bacterial and myofibrillar degradation and biochemical changes during refrigerated storage［J］. Journal of Aquatic Food Product Technology，29（7）：604-615. doi：10.1080/10498850.2020. 1781318.

（責任編輯 羅 麗）