肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7實時熒光PCR檢測方法的研究

楊 滴

（大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116600）

大腸埃希氏菌O157:H7（E.coliO157:H7）是腸出血型大腸埃希氏菌的一種主要血清型，是一種危害嚴重的食源性病原微生物，其廣泛分布于自然界，嚴重威脅公眾健康[1-3]。近年來，由致病性微生物引起的食品污染事件呈上升趨勢。肉及肉制品營養(yǎng)豐富，可滿足人們的需求，但極易滋生各類有害細菌[4]。相關調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉及肉制品受致病菌的污染最為嚴重，而E.coliO157:H7 污染占比很大[5]。

現(xiàn)階段E.coliO157:H7 的主要檢驗方法為微生物分離培養(yǎng)鑒定，其過程煩瑣、費時費力、易產(chǎn)生假陽性[6]。基于TaqMan 探針的實時熒光PCR 技術是微生物檢驗的主要輔助手段，具有高效、特異、精準的優(yōu)點。本研究旨在以E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE為對象，研發(fā)一種肉制品中E.coliO157:H7實時PCR 檢測方法，為肉制品中E.coliO157:H7 的檢測提供技術支持，為市場監(jiān)管提供保障。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用11 株標準菌株，均購于CICC。所有標準菌株信息見表1。

表1 標準菌株信息

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；細菌基因組DNA 提取試劑盒；Premix Ex Taq PCR 試劑盒。

1.3 主要儀器

ABI QS7 Flex 熒光定量PCR 儀；超低溫離心機；DNA 分析儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物與探針

根據(jù)E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE序列，使用Primer express 3.0 軟件設計特異性引物和TaqMan MGB 探針，引物探針由上海生工公司合成，引物及探針序列見表2。

表2 實時熒光PCR 引物及探針序列

1.4.2 DNA 模板制備

將E.coliO157:H7 和其他10 株標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。取100 μL 增菌液，提取DNA 作為實時熒光PCR 模板。

1.4.3 實時PCR 的反應體系及條件

實時熒光PCR 擴增采用20 μL 反應體系，具體各種試劑濃度、體積見表3。

表3 實時熒光PCR 擴增反應體系

實時熒光PCR 反應程序參考試劑盒說明書為95 ℃預變性30 s，然后進入循環(huán)反應，即95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸30 s，共40 個循環(huán)。

1.4.4 特異性研究

將E.coliO157:H7 等11 株標準菌株按照1.4.2制備DNA 模板，并用無菌水作為無模板對照，實時熒光PCR 反應體系和條件按優(yōu)化結果設置，驗證實時熒光PCR 檢測E.coliO157:H7 的特異性。

1.4.5 靈敏性研究

將E.coliO157:H7 標準菌株增菌液進行倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為1×106CFU·mL-1至1×101CFU·mL-1的6 個濃度的菌懸液。每個稀釋度取1 mL 菌懸液，按照1.4.2 制備DNA，探討實時熒光PCR 檢測E.coliO157:H7 的靈敏性。

1.4.6 實際樣品檢測

選取市售鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳和醬牛蹄筋共10 個樣品，分別取上述樣品25 g 放入裝有225 mL營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中，于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取增菌液1 mL 提取DNA 后，進行實時PCR 反應，探討本研究的實用性。

2 結果與分析

2.1 特異性結果

本試驗以CICC 10907E.coliO157:H7 為目標菌株，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌等10 株標準菌株為非目標菌株，高純水為無模板對照，驗證實時熒光PCR 法檢測大腸埃希氏菌O157:H7 的特異性。擴增結果見圖1，只有目標菌株具有擴增曲線，其他10 株非目標菌株無擴增曲線。結果表明，本研究建立的實時熒光PCR 檢測法具有較強的特異性。

圖1 實時熒光PCR 檢測大腸埃希氏菌O157:H7 特異性試驗

2.2 靈敏性結果

分別吸取1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1和1×101CFU·mL-1的E.coliO157:H7 菌懸液1 mL 進行DNA 提取，提取的DNA 進行實時熒光PCR 試驗。E.coliO157:H7 靈敏性試驗結果見圖2。結果顯示，大腸埃希氏菌O157:H7 濃度為1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1時均有擴增曲線濃度低于1×102CFU·mL-1時無擴增曲線，該方法檢測的低限為1×102CFU·mL-1。

圖2 實時熒光PCR 檢測大腸埃希氏菌O157:H7 靈敏性試驗

2.3 實際樣品檢測結果

對鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳、醬牛蹄筋共10 個樣品的營養(yǎng)肉湯增菌液進行DNA 提取，以大腸埃希氏菌O157:H7 為陽性對照，進行實時熒光PCR試驗，擴增結果見圖3。結果顯示，鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉中檢測出含有E.coliO157:H7。

圖3 實時熒光PCR 檢測實際樣品試驗

3 結論與討論

研發(fā)一種靈敏度高、特異性強的快速檢測技術已經(jīng)成為當今社會中肉與肉制品安全監(jiān)測發(fā)展的必然趨勢[7]。長期以來，肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 檢測主要依據(jù)細菌培養(yǎng)、生化鑒定，該方法步驟煩瑣，且耗時長。實時熒光PCR 技術具有靈敏度高、重復性好、反應高效、準確性高、檢測周期短等優(yōu)點[8]，已廣泛應用于分子生物學和醫(yī)學研究等領域[9]。本研究以rfbE基因為目標基因，通過反復摸索，建立了一種特異性強、靈敏性高、切實可行的檢測肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的實時熒光PCR 方法。本研究設計含有不同濃度的大腸埃希氏菌O157:H7（1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1和1×102CFU·mL-1）菌液樣品，試驗得到該檢測方法的低限為1×102CFU·mL-1。本檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的快速檢測奠定了基礎。