桔梗葉醇提工藝優化及其不同部位鎮咳祛痰活性研究*

孫 杰，趙泓瑜，李小蘭，楊金梅，王輝敏，郭麗麗，張朔生△

（1. 山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619； 2. 中藥炮制山西省重點實驗室，山西 晉中 030619）

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A. DC 的干燥根，為歷史悠久的藥食兩用中藥材，具有宣肺祛痰、利咽排膿等功效，在我國分布廣泛［1］。近幾年，隨著研究的逐步深入，中藥傳統非藥用部位的價值逐漸被認識，植物桔梗的地上部位也得到了關注。有研究表明，桔梗葉中含有與其根部類似的黃酮類、皂苷類和多糖類等活性成分［2-4］，從中已鑒定出10余種皂苷類［5-6］、20 余種黃酮類［5-7］、2 種多糖類［5］成分。還有研究表明，桔梗葉中的黃酮類成分含量顯著高于根部［8］。此外，桔梗葉的抗抑郁［9］、抗氧化［10］、抗腫瘤［11］、抗炎［12］等功效也被證實，但這些活性作用所歸屬的化學成分尚待明確。桔梗可通過調節亞油酸、花生四烯酸、甘油磷脂等物質的代謝過程而發揮鎮咳、祛痰作用［13］，桔梗地上部位亦有這些作用［14］，但其活性物質尚不明確。本研究中以單因素試驗結合Box - Behnken試驗優化桔梗葉活性成分的醇提工藝，并對醇提物的不同萃取部位進行鎮咳、祛痰活性評價，以期明確桔梗葉鎮咳、祛痰的主要活性部位，為后續深入揭示其物質基礎奠定理論依據。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

SB25 - 12D 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DE - 500g型多功能粉碎機（浙江紅景天工貿有限公司）；AR223CN 型電子分析天平（奧豪斯儀器< 上海> 有限公司）；RE - 2000B 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Ultra-3000型紫外-可見分光光度計（北京普源精電科技有限公司）；SynergyHTX 型多功能酶標儀（美國Bio Tek 公司）；NIKON Eclipse Ci 型正置顯微鏡（尼康儀器<上海>有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為H17M9Z61362），桔梗皂苷D 對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，批號為210509），含量均大于98.0%；強力枇杷露（廣西維威制藥有限公司，批號為210203，規格為每瓶180 mL）；濃氨水（天津市大茂化學試劑廠，批號為20220502）；苯酚紅（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C13942464）；4%多聚甲醛固定液（武漢博士德生物工程有限公司，批號為16H01A68）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。桔梗葉（采自山西省運城市新絳縣陽王鎮劉域村），經山西中醫藥大學中藥學院張朔生教授鑒定為正品。

1.3 動物

SPF 級KM 小鼠，體質量（18 ± 2）g，雌雄各半，均購自北京斯貝福生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。動物實驗經山西中醫藥大學醫學倫理委員會批準（批準號AWE20221209）。

2 方法與結果

2.1 浸膏得率測定

提取桔梗葉后，記錄所得提取液總體積（V，mL）。先測定10 mL提取液所得浸膏量，再根據下列公式換算成提取液總體積的浸膏量。浸膏得率（%）=［（m2-m1）/10 ×V］/m× 100%。式中，m2（g）為恒重后浸膏和蒸發皿的質量，m（1g）為恒重后蒸發皿的質量，m（g）為稱取的藥材質量（5 g）。

2.2 總黃酮、總皂苷含量測定

以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法［8］，于510 nm波長處測定吸光度，以總黃酮質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、吸光度值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y1= 0.013 3X1+ 0.039 5（R2= 0.999 2），取1 mL提取液，同法顯色，計算總黃酮含量。以桔梗皂苷D為對照品，采用香草醛- 高氯酸法［15］，于475 nm 波長處測定吸光度，以總皂苷質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y2=0.006 3X2+0.028 9（R2=0.999 2）。取1 mL 提取液，同法顯色，計算總皂苷含量。

2.3 單因素試驗

以桔梗葉為原料，以浸膏得率、總黃酮含量、總皂苷含量及三者的綜合評分為評價指標，考察乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取溫度4個因素對醇提工藝的影響。提取的固定條件為超聲功率500 W、提取2 次。設浸膏得率、總黃酮含量、總皂苷含量所占權重分別為40，30，30，綜合評分=40×浸膏得率/各水平浸膏得率平均值+ 30 × 總黃酮含量/各水平中總黃酮含量平均值+30×總皂苷含量/各水平中總皂苷含量平均值。

乙醇體積分數：隨著乙醇體積分數的升高，桔梗葉中各成分提取量及浸膏得率均總體上升，當乙醇體積分數為40%時，綜合評分最高，故乙醇體積分數選擇40%。詳見表1。

表1 不同乙醇體積分數對提取效果的影響（）Tab.1 Effect of ethanol with different volume fractions on the extraction results（）

表1 不同乙醇體積分數對提取效果的影響（）Tab.1 Effect of ethanol with different volume fractions on the extraction results（）

乙醇體積分數（%）30 40 50 60 70浸膏得率（%）23.03±0.40 23.50±0.32 21.90±0.64 20.40±2.41 18.59±1.81總黃酮提取量（mg/g）41.96±2.37 47.72±3.09 46.23±0.33 45.58±0.44 41.45±0.73總皂苷提取量（mg/g）93.15±5.56 104.34±5.21 109.27±2.36 99.37±3.20 111.33±2.62綜合評分98.62±3.10 106.47±0.48 103.69±1.16 99.45±2.17 94.94±3.51

液料比：隨著液料比的逐漸增加，桔梗葉中各成分的提取量及浸膏得率均總體呈上升，當液料比超過20∶1（mL/g，下同）后，上述指標變化趨于平緩，綜合評分的變化幅度也較小，故液料比選擇20∶1。詳見表2。

表2 不同液料比對提取效果的影響（）Tab.2 Effect of different liquid - solid ratios on the extraction results（）

表2 不同液料比對提取效果的影響（）Tab.2 Effect of different liquid - solid ratios on the extraction results（）

液料比（mL/g）10∶1 15∶1 20∶1 25∶1 30∶1浸膏得率（%）21.96±0.45 25.68±0.39 27.42±0.38 27.07±0.42 27.76±1.82總黃酮提取量（mg/g）43.14±1.41 55.12±2.10 59.65±3.45 62.21±2.44 56.01±0.47總皂苷提取量（mg/g）98.26±2.09 130.45±2.42 135.26±1.96 133.13±4.39 140.28±1.01綜合評分80.32±1.57 99.93±1.10 106.17±2.92 105.51±1.54 105.75±3.04

提取時間：隨著提取時間的延長，桔梗葉中各成分的提取量及綜合評分均總體上升，在40 min 時綜合評分最高，此后繼續延長提取時間，上述指標也無明顯變化，故提取時間選擇40 min。詳見表3。

表3 不同提取時間對提取效果的影響（）Tab.3 Effect of different extraction time on the extraction results（）

表3 不同提取時間對提取效果的影響（）Tab.3 Effect of different extraction time on the extraction results（）

提取時間（min）20 30 40 50 60浸膏得率（%）25.36±0.54 26.40±0.30 26.71±0.06 26.07±0.56 26.77±0.44總黃酮提取量（mg/g）57.75±1.51 59.05±0.48 63.97±1.29 60.30±1.52 60.49±1.94總皂苷提取量（mg/g）109.54±4.60 106.78±2.26 136.06±0.72 133.59±1.48 135.48±0.61綜合評分91.74±0.20 101.13±0.58 104.25±0.69 101.46±1.20 102.48±1.01

提取溫度：隨著提取溫度的升高，桔梗葉中各成分的提取量及浸膏得率均總體升高，綜合評分在60 ℃時最高，故提取溫度選擇60 ℃。詳見表4。

表4 不同提取溫度對提取效果影響（）Tab.4 Effect of different extraction temperatures on the extraction results（）

表4 不同提取溫度對提取效果影響（）Tab.4 Effect of different extraction temperatures on the extraction results（）

提取溫度（℃）30 40 50 60 70 23.96±1.00 25.96±0.91 26.36±0.40 26.17±0.24 26.15±1.25 45.54±1.28 48.77±1.64 51.30±0.35 65.67±3.03 49.21±0.59 94.32±4.07 104.57±7.34 110.86±5.69 100.61±3.36 112.20±5.46 89.47±2.47 97.22±3.31 98.34±2.26 106.46±2.49 97.08±3.60浸膏得率（%）總黃酮提取量（mg/g）總皂苷提取量（mg/g）綜合評分

2.4 Box-Behnken 試驗

試驗設計：在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數（因素A）、液料比（因素B）、提取時間（因素C）、提取溫度（因素D）為考察因素，以綜合評分（Y）為評價指標，采用響應面法確定最優醇提工藝。因素與水平見表5。試驗設計與結果見表6。

表5 因素與水平Tab.5 Factors and their levels

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.6 Design and results of Box - Behnken test

模型擬合：采用Design - Expert V8.0.6.1 軟件對試驗數據進行分析，得回歸方程Y=106.95+0.012A+3.83B-0.064C-1.00D+4.45AB+1.28AC-2.72AD+2.70BC+ 0.11BD- 1.82CD- 4.62A2- 6.05B2-5.75C2-0.51D2。

方差分析：將模型的回歸參數進行方差分析，結果見表7。回歸模型為極顯著水平（P< 0.000 1），失擬項不顯著（P>0.05），模型的決定系數（R2）為0.959 9，調整決定系數（R2Adj）為0.919 9，說明可解釋91.99%的響應值變化，表明模型成立。該模型的顯著性檢驗顯示，一次項B，交互項AB，AD，BC，平方項A2，B2，C2的影響均達極顯著水平（P<0.01），一次項D、交互項CD 的影響達顯著水平（P< 0.05）。各因素對響應值的影響不同，對綜合評分影響大小順序為B>D>C>A。

表7 Box-Behnken試驗回歸模型方差分析結果Tab.7 Results of ANOVA of regression model of Box - Behnken test

響應面預測：利用Design-Expert 軟件分析回歸方程，得各因素交互影響桔梗葉綜合評分的三維響應面圖［16］（見圖1）。可見，因素A 與B、A 與D、B 與C、C 與D交互作用顯著，表明兩者交互作用對綜合評分影響程度大，與方差分析結果一致。

圖1 各試驗因素交互作用的響應面圖Fig.1 Response surface diagrams of the interaction of various factors

2.5 醇提工藝驗證

經軟件預測，桔梗葉最佳醇提工藝為乙醇體積分數44.2%、液料比22.8∶1、提取時間42.81 min、提取溫度55.68 ℃。綜合評分為108.567分。考慮到實際操作的可行性，將最佳工藝條件確定為乙醇體積分數44%、提取溫度56 ℃、液料比23∶1、提取2次，每次43 min，進行3次平行驗證試驗，此條件下其浸膏得率為（29.84± 0.93）%，總黃酮提取量為（65.3 ± 1.93）mg/g，總皂苷提取量為（122.9 ± 4.51）mg/g。綜合評分的平均值為108.682分，與預測值接近。

2.6 鎮咳、祛痰活性測定

桔梗葉醇提物萃取部位制備：取210 g 桔梗葉粉末，按最佳工藝提取，合并溶液，回收乙醇濃縮得浸膏（62 g），按液料比20∶1 溶于水中，分別用不同極性溶劑等體積萃取3 次，減壓回收溶劑，于60 ℃干燥至恒重，計算浸膏得率。依次得到石油醚（23.76%）、二氯甲烷（0.44%）、乙酸乙酯（15.04%）、正丁醇（6.99%）和水（29.64%）萃取部位。

分組與給藥：將80只KM小鼠隨機分為空白組（A組，等體積0.5%CMC - Na），模型組（B 組，等體積0.5%CMC - Na），強力枇杷露組（C 組，5.65 mL/ kg），石油醚萃取部位組（D組，360 mg/kg），二氯甲烷萃取部位組（E 組，6.67 mg/ kg），乙酸乙酯萃取部位組（F 組，228 mg/kg），正丁醇萃取部位組（G 組，106 mg/kg），水萃取部位組（H 組，449.54 mg/kg），各10 只。各組小鼠給予灌胃0.5%CMC-Na或藥物，每天1次，連續7 d。給藥劑量依據，以D 組為例，將桔梗葉每日用量設為10 g（參考桔梗的每日臨床用量），石油醚萃取部位得率為23.76%，故D 組的給藥量為360 mg/ kg（10 × 9.1 ×23.76%/60 kg）。

鎮咳實驗：參照文獻［17］，在倒扣的500 mL 燒杯中放入1 個質量為0.5 g 的棉球，隨后注入300 μL 氨水，飽和1 min 后迅速將末次給藥30 min 后的小鼠放入其中，45 s 后取出，放于另一個倒扣的干凈燒杯中，記錄小鼠引咳后3 min 內的咳嗽次數和咳嗽潛伏期（超過3 min 以3 min 計）。采用GraphPadPrism 8.0.2 軟件軟件處理數據（下同）。結果，與B 組比較，C - H 組小鼠3 min 內咳嗽次數均顯著減少，咳嗽潛伏期均顯著延長（P<0.01）。詳見表8。

表8 各組小鼠的咳嗽次數及潛伏期比較（n=10）Tab.8 Comparison of cough frequency and cough latency in each group（n=10）

祛痰實驗：1）酚紅排泌量。末次給藥30 min 后，小鼠腹腔注射酚紅溶液。取小鼠氣管，將其置于生理鹽水與NaHCO3混合液中浸泡過夜，后以3 000 r/ min 離心15 min，取上清液。于560 nm 波長處測定吸光度值，計算酚紅排泌量［18］。結果，與B 組比較，C 組、F 組小鼠酚紅排泌量顯著增加（P<0.01）。詳見表9。2）肺部組織病理形態。處死小鼠后，將其置冰臺上固定，剪去肺臟，用生理鹽水清洗、濾紙吸干水分，剪取一部分右肺置4%多聚甲醛固定液中包埋，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察小鼠肺部組織及肺泡結構、肺出血情況、肺泡及血管壁的炎性細胞浸潤、肺泡壁是否增厚等病理變化。結果，A組小鼠肺組織結構正常，未見病理變化。B組小鼠肺部組織病理變化明顯，出現肺泡壁充血、肺泡融合、肺泡腔中出現炎性細胞浸潤（以中性粒細胞為主）及少量紅細胞。與B 組比較，C 組小鼠肺部組織狀態改善極大，結構接近正常，僅有少量肺泡融合現象，肺泡中可見少量紅細胞，D - H 組小鼠肺泡融合、炎性細胞浸潤程度均減輕，尤其是F組小鼠肺泡結構趨于正常，僅有輕微的肺泡融合現象，且肺泡腔中未見紅細胞。詳見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理形態比較（HE染色，×400）Fig.2 Comparison of pathological morphology of lung tissue in each group（HE staining，× 400）

表9 各組小鼠酚紅排泌量比較（n=10）Tab.9 Comparison of PSP excretion amount in each group（n=10）

3 討論

本研究中采用多指標響應面法對桔梗葉醇提工藝進行優化，在最優條件下總黃酮提取量為65.3 mg/g。有研究采用酶解-超聲耦聯法優化桔梗莖葉總黃酮的提取工藝，最優工藝條件下總黃酮得率為6.35%［19］，與本研究結果（6.53%）相當，說明超聲法適用于桔梗地上部分總黃酮的提取。謝雄雄等［20］的研究表明，桔梗60%乙醇提取物可發揮鎮咳活性，而本研究中考察的不同萃取部位由桔梗葉44%乙醇提取物制備而來，同樣具有顯著的鎮咳活性，提示采用適當體積分數的乙醇可有效提取桔梗中的鎮咳活性物質。此外，張遲［21］的研究表明，桔梗皂苷類成分是桔梗鎮咳的主要物質基礎，而本研究結果表明桔梗葉的鎮咳活性可能是不同萃取部位中多類別成分協同作用的結果，具體的功效成分有待后續進一步研究揭示。

桔梗葉醇提物乙酸乙酯萃取部位表現出較其他萃取部位更強的鎮咳祛痰活性。有研究表明，該部位含醇類5 種，黃酮類、皂苷類、酸類各3 種，內酯、烷烴、烯類成分各1 種［6］，而賈正等［22］發現，桔梗根乙酸乙酯部位包括5種醇類、3種皂苷類和1種黃酮類成分，LI等［23］又發現桔梗根乙酸乙酯部位包括11種木脂素、4種酚類化合物及2 種新型化合物（+）-（7R，8R）-palmitoyl ala?tusol D、（+）-（7R，8R）-linoleyl alatusol D。由此可見，桔梗葉和桔梗根乙酸乙酯萃取部位中均含有皂苷類成分，這可能是桔梗葉鎮咳祛痰的活性成分之一。此外，桔梗根乙酸乙酯萃取部位具有區別于葉部的木脂素類成分，而葉部乙酸乙酯萃取部位具有區別于根部的烷烴、烯類、內酯類等成分，這些成分的差異導致生物活性的不同，具體的活性差異還有待進一步研究。目前尚未見桔梗葉鎮咳祛痰活性的相關文獻報道，同時考慮到桔梗根與葉之間成分的差異性，有必要采用譜效關聯、代謝組學等方法進一步明確桔梗葉鎮咳祛痰的活性物質基礎。

就作用機制而言，本研究結果初步表明桔梗葉可通過減輕模型小刀肺部充血、改善人肺部狀態，從而發揮鎮咳祛痰作用，但具體作用機制有待進一步探討。單進軍等［24］的研究表明，桔梗湯中有效成分主要通過與TLR4，MMP9，IKK2 蛋白結合以抑制呼吸道炎癥、降低氣道黏蛋白水平、降低咳嗽中樞敏感性等方式發揮鎮咳祛痰作用，然而桔梗葉的鎮咳祛痰作用機制是否與其一致還有待驗證。后續可通過研究備受關注的鎮咳祛痰通路［25-27］（如TRPA1、TRPV1 信號通路、MU5ac 蛋白表達）、炎癥通路指標［28］白細胞介素1β）等揭示桔梗葉的鎮咳祛痰作用機制及其與根部的異同。

綜上所述，經超聲功率500 W，乙醇體積分數44%，液料比23∶1，提取時間43 min，提取溫度56 ℃，提取2 次而得的桔梗葉醇提物，其乙酸乙酯萃取部位較其他萃取部位具有更明顯的鎮咳祛痰活性。但其具體的成分組成尚待進一步研究。本研究為桔梗葉的深入開發與精準利用提供了理論依據，為將其作為鎮咳祛痰功能食品原料提供了依據。