Box-Behnken 響應面法優選柴銀顆粒中揮發油提取工藝*

黃孟秋，邱榮英，李因坤，李 倩，杜昊忱△

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006； 2. 中藥制藥共性技術國家重點實驗室<魯南制藥集團>，山東 臨沂 276006； 3. 山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 276006）

柴銀顆粒為《傷寒六書》中的柴葛解肌湯和《溫病條辨》中的銀翹散化裁而成，由柴胡、金銀花、黃芩、葛根、荊芥等11味中藥組方，能清熱解毒、利咽止咳，治療發熱惡風、咳嗽、咽喉腫痛、鼻塞流涕、頭痛等的效果良好［1-3］。方中柴胡、金銀花、荊芥、薄荷、魚腥草、青蒿及連翹7 味藥材均含豐富的揮發性成分，具有發汗解熱、抗炎、抗菌、抗病毒等多種藥理活性［4-11］，但其性質不穩定，長時間高溫提取易造成有效成分損失，故柴銀顆粒在制劑生產中會優先提取揮發油［12］。中藥揮發油提取方法包括水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波提取法等。其中水蒸氣蒸餾法具有操作簡便、效率較高等優點，適用于工業化大生產［13-15］。本研究中采用水蒸氣蒸餾法對7 味藥材中揮發油的提取工藝進行探討，采用Box-Behnken響應面法優選最佳提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ML6002T/ 02 型電子天平（梅特勒- 托利多儀器< 上海> 有限公司，精度為0.01 g）；揮發油提取器（南京康洛達實驗科技有限公司）；KDM 型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.2 試藥

柴胡（批號為4597210010）、金銀花（批號為453021033）、薄荷（批號為452421008）、連翹（批號為453121020）的藥材飲片，均購自山東百味堂中藥飲片有限公司；荊芥（批號為452721002）、青蒿（批號為452828007）、魚腥草（批號為452621005）的藥材飲片，均購自安徽人民中藥飲片有限公司。上述藥材飲片樣品均由中藥制藥共性技術國家重點實驗室（魯南制藥集團）范建偉高級工程師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取

根據柴銀顆粒處方及工藝，按0.4 倍處方量稱取柴胡100 g，金銀花、青蒿、連翹、薄荷、魚腥草各75 g，荊芥50 g，置圓底燒瓶中，加適量飲用水（下同），浸泡，連接揮發油提取器及上方冷凝管，置控溫電熱套中加熱至沸騰，并保持微沸狀態，收集揮發油，測定揮發油提取量。

2.2 單因素試驗

浸泡時間：按2.1 項下方法，設定加水量為10 倍量，提取時間為3 h，浸泡時間分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0 h。結果見圖1 a。可見，浸泡時間在0～0.5 h 范圍內，揮發油提取量隨提取時間的延長而增多，0.5 h時達最大值；在0.5～2.0 h 范圍內，揮發油提取量總體下降。故浸泡時間選擇0～1.0 h。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of the single factor test

加水量：按2.1 項下方法，設定浸泡時間為0.5 h，提取時間為3.0 h，加水量分別為6，8，10，12，14 倍。結果見圖1 b。可見，加水量在6～10 倍范圍內，揮發油提取量隨加水量的增加而增多，加水量為10 倍量時達最大值；在10～14 倍范圍內，揮發油提取量總體下降。故加水量選擇8～12倍。

提取時間：按2.1項下方法，設定浸泡時間為0.5 h，加水量為10 倍，提取時間分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h。結果見圖1 c。可知，提取時間在1.0～4.0 h 內，揮發油提取量隨提取時間的延長而增多，4.0 h 時達最大值；在4.0～5.0 h 內，揮發油提取量總體下降。故提取時間選擇3.0～5.0 h。

2.3 Box - Behnken 響應面試驗

試驗設計與結果：在單因素試驗基礎上，采用Design - Expert 13 軟件，以浸泡時間（因素A）、加水量（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，以揮發油提取量為評價指標，進行Box-Behnken 響應面試驗。因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.2 Design and results of Box-Behnken test

模型擬合與方差分析：對表2中的試驗結果進行模型擬合，以各因素為自變量，以揮發油提取量（Y，mL）為因變量，可得回歸方程Y=2.63+0.123 6A+0.052 3B+0.136 2C+ 0.102 0AB- 0.045 0AC- 0.062 5BC-0.140 2A2-0.246 9B2-0.144 9C2。方差分析結果（表3）顯示，該模型F值為42.19，P<0.000 1，表明該模型有顯著差異；且失擬項P=0.624 1>0.05（不顯著），表明模型建立成功。回歸方程R2=0.98，該模型對試驗數據的擬合情況較好；決定系數R2Adj=0.96，與實測值相差較小，表明模型可行性較高；變異系數為1.97，信噪比為17.73，表明模型具有較高的準確度和可信性。對揮發油提取量的影響大小順序為因素C>因素A>因素B。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the ANOVA

響應面圖與等高線分析：分別以因素A、因素B、因素C 為響應因子，以揮發油提取量為響應值，繪制響應面圖及等高線圖（圖2）。初步得到揮發油最佳提取工藝為浸泡0.83 h，加9.9 倍量水，提取4.6 h。在此條件下，揮發油提取量預測值為2.66 mL。結合實際工業生產條件，對預測的工藝參數進行微調，最終確定揮發油最佳提取工藝為浸泡1.0 h，加10倍量水，提取4.0 h。

圖2 各因素間交互作用的響應面圖及等高線圖Fig.2 Response surface diagrams and contour diagrams of interaction among various factors

2.4 驗證試驗

按2.1項下方法，根據上述最佳提取工藝進行驗證試驗，平行3 次。結果揮發油提取量分別為2.63，2.57，2.61 mL，平均（2.60±0.03）mL，RSD為1.17%（n=3），實測值與預測值的均方誤差為0.001 3。提示方程與真實試驗擬合較好，優選的工藝穩定可行。

3 討論

柴銀顆粒對上呼吸道感染初期伴有的發熱、咽痛、乏力等癥狀具有一定療效，方中柴胡、金銀花、荊芥、青蒿、連翹、薄荷、魚腥草的揮發性成分具有發汗解表、清熱解毒功效。目前，已有報道對柴胡、金銀花、青蒿等單味藥材中揮發油的提取工藝進行了研究［16-18］。

本研究中單因素試驗結果表明，浸泡時間、加水量及提取時間對揮發油提取量的影響均呈先升高后降低的趨勢。這是由于在提取揮發油過程中，分子處于動態變化，提取時間、浸泡時間及加水量不足，不利于揮發油提取完全；提取時間和浸泡時間過長或加水量過多可能會影響揮發油分解與轉化，進而降低收率。本研究中通過Box- Behnken 響應面法擬合了浸泡時間、加水量、提取時間與揮發油提取量之間的函數關系，方差分析結果表明，3 個因素均對制劑中揮發油的提取量有顯著影響，其中提取時間影響最顯著。根據Box-Behnken響應面法試驗結果，考慮到能源消耗等問題，最終確定柴銀顆粒中揮發油的最佳提取工藝為浸泡1.0 h，加10 倍量水，提取4.0 h，可為柴銀顆粒工業化生產提供參考。

揮發油提取是中藥提取的重要步驟，對藥物療效有重要影響。但目前部分標準中柴銀顆粒含量測定的指標性成分為黃芩苷，揮發性成分大多僅作定性鑒別，不利于全面控制柴銀顆粒的質量。故在后續研究中可采用氣相色譜-質譜聯用法等分析柴銀顆粒揮發油中的主要成分，建立相應的含量測定方法，為提升制劑質量和完善其評價標準提供參考。