淫羊藿藥材中黃酮類成分提取工藝優選*

張秀秀，楊 潔，何 潔，王仕寶△，何志鵬，房 宇，張 慧，向 儀

（1. 漢中職業技術學院藥學院，陜西 漢中 723000； 2. 漢中職業技術學院秦巴山區藥〈食〉用植物研究所，陜西 漢中 723000； 3. 陜西省漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000； 4. 陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 西安 712046）

淫羊藿為小檗科淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Max?im.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥葉［1］，具有補腎壯陽、益精補氣等功效，主治腰膝酸軟、風濕痹痛、四肢麻木不仁等病癥［2］。有研究表明，其在抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤細胞生長、控制心血管系統疾病中療效顯著［3-4］。淫羊藿總黃酮（TFE）為淫羊藿藥材最主要的化學成分，現代藥理學研究表明，TFE對內分泌組織、免疫系統、骨與腫瘤及心腦血管系統均有益［5-7］。基于此，本研究中通過響應面法，以朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ等6 種黃酮類成分總含量為評價指標，優選淫羊藿藥材最佳提取工藝。現報道如下。

(4) 2臺FEP采用自開發軟件接口協議與外部時鐘源同步，但無法確保2臺FEP的時鐘精度偏差均在50 ms內(僅采用NTP或PTP協議時才能確保精度在50 ms內)，不能同時為下一層提供時鐘源服務。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260B 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；DS-8510DTH型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XSR205DU 型精密電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

朝藿定A1對照品（批號為P02J9S64790）、朝藿定A對照品（批號為P02J9F64787）、朝藿定B對照品（批號為G19A11L121806）、朝藿定C對照品（批號為N18GB166250）、淫羊藿苷對照品（批號為T11A11B111118）、寶藿苷Ⅰ對照品（批號為A20GB158231），均購于上海源葉生物科技有限公司（含量≥98%）；乙腈、甲醇、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。淫羊藿藥材樣品于2020年5月1日采集于陜西省漢中市寧強縣，經漢中職業技術學院秦巴山區藥（食）用植物研究所王仕寶副教授鑒定為箭葉淫羊藿的干燥葉；選取綠色鮮艷、完整葉片陰干后保存；試驗前將藥材樣品粉碎（過3 號篩），密封，備用。

在政策和資金扶持上，各縣（市）均出臺了招商引資優惠政策。其中，麻江縣規定對在規劃區內規模連片種植3.33 hm2以上規定品種經濟林的，政府均免費提供苗木或按1.35萬～1.5萬元/hm2的標準給予苗木費補助；對種植業主申請銀行貸款用于發展經濟林、中藥材等水土保持林草建設的，在規定年限和貸款額度內政府給予貼息。雷山縣規定利用荒山或坡耕地種植茶葉并驗收合格的，一次性補助0.6萬元/hm2，對每個加工廠一次性補助5萬元。岑鞏縣政府則直接出資180萬元，扶持投資者建成油茶、核桃基地667多hm2。黃平縣在肥料、財稅、土地、規費等方面對民間投資者給予相應扶持。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

系統適用性試驗：取上述混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，理論板數按淫羊藿苷峰計應大于8 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

色譜柱：AgilentEclipsePlus-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min時74%A，35～36 min 時74%A →55%A，36～45 min 時55%A →53%A，45～60 min 時53%A →47%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，制得質量濃度分別為675，698，684，679，657，636 μg/mL的單一對照品溶液；分別精密量取適量，混合，即得混合對照品溶液。取藥材樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密量取50%乙醇10 mL 置錐形瓶中，稱定質量，超聲（功率600 W、頻率40 kHz，下同）提取60 min，冷卻，再次稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液，經0.22μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.2 溶液制備

2.1.3 方法學考察

在1917年法國皮卡第的一場戰斗中，德軍突破了防線，直接沖入了英法聯軍的陣地，正在挖戰壕的華工們猝不及防，他們只得用鐵鍬、鎬頭與德國兵肉搏，當英法聯軍趕到時，大部分華工已戰死。

考慮到新增匝道的駛入、駛出點必須在現有道路的某一側，因此以上圖中新增匝道②-①為實例工程進行分析，可知其可行的駛入、駛出點均為3處，因此可行的新增匝道方案如圖3所示。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.1.2項下混合對照品溶液適量，制成系列混合對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系與檢測限、定量限考察結果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantification

提取時間：固定液料比為100，以50%乙醇分別超聲提取20，30，40，50，60 min，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明，提取40 min 時待測成分提取總量最高，隨后開始逐漸下降，故選擇提取時間為40 min。詳見圖3 b。

液料比：在液料比分別為50，100，150，200，250 的條件下，以50%乙醇超聲提取60 min，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明，液料比為50，100時待測成分提取總量較高。因液料比為50時，提取溶液過于濃稠，不方便過濾，且各成分峰面積、峰高相差較大，故選擇料液比為100。詳見圖3 a。

穩定性試驗：取2.1.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為2.50%，1.57%，1.92%，0.46%，1.62%，1.43%，（n= 6），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取樣品適量，精密稱定，各6 份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為1.15%，1.83%，0.74%，1.47%，2.89%，0.92%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共9 份，分別加入80%，100%，120%質量濃度的混合對照品溶液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的平均加樣回收率分別為99.96%，100.34%，99.98%，100.48%，100.22%，101.11%，RSD分別為0.19%，0.41%，1.93%，1.95%，0.80%，2.39%（n=9）。

2.2 單因素試驗

模型擬合：采用Design Expert 11 軟件進行多元回歸擬合，得待測成分提取總量（Y）與各因素變量的關系方程：Y= 3.118 + 0.115A- 0.034 2B+ 0.024 2C+0.055 0D- 0.192 5AB- 0.072 5AC- 0.005AD-0.01BC-0.055BD+0.06CD-0.2398A2-0.04858B2-0.098 58C2-0.187 3D2。

圖2 試劑體積分數對提取總量的影響Fig.2 Effect of volume fraction of solvent on the total extraction amount

精密度試驗：取2.1.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為0.38%，0.30%，0.32%，0.35%，0.56%，0.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖3 不同因素對提取總量的影響Fig.3 Effect of different factors on the total extraction amount

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.1.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3︰1、10︰1 時各成分的質量濃度分別計為檢測限、定量限。結果見表1。

提取次數：固定液料比為100，以50%乙醇超聲提取1～4 次，每次40 min，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明，當提取次數超過2 次時，總黃酮的提取率緩慢下降，故選擇提取次數為2 次。詳見圖3 c。

2.3 響應面法設計

試驗設計：根據上述單因素試驗結果，以乙醇體積分數（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）、液料比（因素D）為考察因素，待測成分提取總量為考察指標，采用響應面軟件Design Expert 11.0 優選提取工藝［8-12］。因素與水平見表2，響應面試驗設計及結果見表3。

1）繪圖計算。主要用于圖形界面的繪圖操作，如繪制深度信息的時間曲線。繪圖操作通過Qt的繪圖類QPainter等實現。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 響應面試驗設計及結果Tab.3 Design and results of the response surface test

提取溶劑：固定液料比為100（mL/ g，下同），以不同溶劑超聲提取60 min，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果表明，50%乙醇、50%甲醇作為提取溶劑時待測成分提取總量均較高，因甲醇毒性、揮發性較強，乙醇較安全、經濟、環保，故選擇50%乙醇作為提取溶劑。詳見圖2。

方差分析：模型回歸參數方差分析結果見表4。該模型較顯著（F= 4.60，P< 0.003 6），表明響應回歸模型差異有統計學意義；模型中失擬項不顯著（F=1.91，P =0.279 0 > 0.05），表明該模型設計合理。方程中A，AB，A2，D2對待測成分提取總量的影響有統計學意義，故可用此模型對提取工藝進行分析和預測。結果表明，因素A 具有顯著意義，為主要因素；因素D 影響強度大于因素B、因素C，因素D 是影響提取總量的次要因素。

統計1970—1998年和1999—2016年Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區相對濕度、日平均溫度、日照時間和日平均風速年序列，由圖4可知，相對濕度隨海拔增加而減小，海拔低于1500 m的區域相對濕度約為80%，而在1500 m以上區域，相對濕度降至60%~65%；日平均溫度隨海拔升高而降低；日照時間和風速則隨海拔增加而增加，且日照時間隨海拔變化的變化幅度和相對濕度變化較為一致。

實驗結論分析 在學期末對實驗組和對照組進行一對一聽說測試，測試標準參照文獻[5]中的“加德納的社會—教育模式”（見圖2），對幼兒進行正規語境和非正規語境兩個方面的測試。本研究中正規語境的測試題目由學前教育專家指導，鄉鎮統一制定。測試結束后，用SPSS軟件對實驗組和對照組的測試成績進行顯著性差異檢驗。非正規語境的測試主要由監考教師反饋整理。

表4 回歸模型的方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA of regression model

響應面預測與驗證：采用Design - Expert 11.0 軟件分析試驗結果，得到提取總量與各因素交互作用的三維響應面圖和等高線圖。因素AD 間、CD 間交互作用較強，結果影響顯著。淫羊藿藥材最佳提取工藝為液料比為100 時，以50%乙醇提取2 次，每次40 min。詳見圖4。

圖4 不同影響因素間響應面圖及等高線圖Fig.4 Response surface diagrams and contour diagrams of different influencing factors

驗證試驗：驗證最佳工藝，平行3次，結果藥材樣品中待測成分提取總量分別為3.16%，3.08%，3.03%，與預測值（3.12%）相當。

3 討論

由于產地、采收季節、生長方式、干燥方式、淫羊藿藥材種類、提取檢測方法不同，淫羊藿藥材中黃酮類成分的種類和含量也存在一定差異。預試驗中考察提取工藝時，比較了醇提法、水提法、超聲醇提法［13-17］，發現超聲醇提法對黃酮類成分的提取量相對較高，故選擇該法。按響應面法軟件構建的最佳提取工藝進行驗證，淫羊藿葉中6種成分提取總量的實際測定值與預測值基本一致。預試驗中還分別以水-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈［18］、0.1%甲酸水溶液-乙腈［19］作為流動相進行梯度洗脫，發現以0.1%磷酸水溶液-乙腈和水-乙腈作為流動相時，色譜峰峰形良好，分離度大，拖尾不明顯，但由于以磷酸鹽作為流動相，在質量濃度較低時易結晶析出，易造成色譜柱堵塞，沖洗色譜柱耗時較長，故選擇水-乙腈作為流動相。在流動相梯度變化時間范圍內，適當縮小水相的質量濃度，即可將待測6 種黃酮類成分完全分開，且出峰時間也會隨之縮短，前期試驗中的標準品溶液是用純甲醇配制的，6 種成分的峰形均為前沿峰，后續在配制標準品溶液時，加入了少量的水，使其成為含水12%～15%的甲醇溶液，進樣分析后發現峰形前沿情況明顯改善，峰形和分離度較好。

2020 年版《中國藥典（一部）》［1］明確淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的總量不得少于1.5%，其中朝鮮淫羊藿不得少于0.5%。朝藿定A1因性質和朝藿定A接近，故在相同色譜條件下也能被分離出。寶霍苷Ⅰ是淫羊藿苷在體內的水解產物［2］，具有顯著的抗氧化、抗骨質疏松［3］、抗腫瘤活性，2020 年版《中國藥典（一部）》將其列為炙淫羊藿藥材含量測定的指標成分之一［1］，由于淫羊藿總黃酮在淫羊藿的化學成分中的含量最高［3］，藥理作用強，臨床應用廣，故將2 種黃酮類成分納入本次考察。

綜上所述，本研究中優選的提取工藝合理可行，可為淫羊藿藥材的進一步研發提供參考。