白英藥材飲片質量標準及指紋圖譜研究*

萬麗娟，黃茜茜△，林 露，胡 輝，3，龍 林，瞿彩麗

（1. 勁牌持正堂藥業有限公司，湖北 黃石 435000； 2. 湖北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，湖北 黃石435000； 3. 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000）

白英為茄科植物白英Solanum lyratumThunb. 的干燥全草，具有清濕熱解毒、祛風利濕、化瘀功效［1］，常用于肝癌、肺癌、宮頸癌、胃癌等多種癌癥的治療［2-8］。白英藥材主要含有機酸類、苷類、黃酮類、倍半萜類等多種化合物［9-13］，含量測定多集中于綠原酸、咖啡酸、薯蕷皂苷元等［14-15］，指紋圖譜涉及較少。目前，白英藥材飲片及其配方顆粒質量標準中僅有薄層色譜鑒別，無含量控制指標，質量標準單一，本研究中進行了白英藥材飲片含量測定及指紋圖譜探討［1］，建立了完善的質量標準，以為白英藥材飲片、配方顆粒、相關制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 系列超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters 2695型超高效液相色譜儀，包括G1211A型四元梯度泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G1314BVWD型檢測器（美國Waters公司）；AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；OQ015XXM 型超純水系統（英國Elga 公司）；SK8200LHC 型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753-201018，含量為96.1%）；新綠原酸對照品（批號為DSTDX001503），隱綠原酸對照品（批號為DST190908-035），均購自成都德思特生物技術有限公司，含量均為98.0%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。白英藥材飲片樣品分別購自安徽亳藥千草中藥飲片有限公司（批號分別為2004043，2005047，2005117，產地均為湖北省），河北康盛華藥業有限公司（批號分別為22010921，22020424，22030231，產地均為河北省），成都吉安康藥業有限公司（批號分別為22010921，22020323，22010745，產地均為四川省），湖北正光九資河藥業有限公司（批號分別為201201，201203，201204，產地均為河南省），亳州市盛林藥業有限責任公司（批號分別為202102，202105，202103，產地均為湖北省）。

2 方法與結果

2.1 浸出物含量

按2020年版《中國藥典（四部）》浸出物測定法項下醇溶性浸出物測定法，測定15批樣品的浸出物含量。結果浸出物含量為7.51%～13.37%，平均9.63%。限度按測定結果平均值的80%計算，初步擬訂浸出物含量不得低于8%，結果有2批浸出物含量不合格。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：甲醇- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；流速：0.3 mL / min；檢測波長：327 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

2.2.2 溶液制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含5μg的對照品溶液。取藥材飲片樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率300 W，頻率53 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按綠原酸峰計應不低于4 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms

線性關系考察：稱取綠原酸對照品10.48 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，得質量濃度為201.425 6 mg/L 的綠原酸對照品貯備液；分別取0.2，0.5，1，2，4，6 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容；取1μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以綠原酸質量濃度（X，mg/ L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=10 006X+790.25（R2=0.999 9，n=6）。結果表明，綠原酸質量濃度在1.611 4 ～48.342 1 mg/L 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果綠原酸峰面積的RSD為0.08%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液（樣品批號為2004043）適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果綠原酸峰面積的RSD為0.68%（n= 7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為2004043）適量，精密稱定，各6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果綠原酸平均含量為0.064%，RSD為1.65%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為2004043）適量，共9 份，分別加入低、中、高質量濃度的綠原酸對照品溶液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取各批樣品適量，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果15批樣品中綠原酸含量為0.037%～0.080%，平均0.057%。含量限度按測定結果平均值的± 30%計算，故暫定白英藥材飲片中綠原酸含量不得少于0.040%。

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB Aq C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.8μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min 時4%A →20%A，25～35 min 時20%A →30%A）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：1μL。

2.3.2 方法學考察

按相關規定進行精密度、穩定性、重復性試驗，結果儀器響應值的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度、供試品溶液穩定性、方法重復性均良好。

2.3.3 指紋圖譜建立

取15批樣品，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，15批樣品UPLC疊加指紋圖譜見圖2。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A 版）分析數據，設批號為2004043 的樣品的色譜圖為參照圖譜（編號S1），其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，即得白英藥材飲片共有模式的對照指紋圖譜。詳見圖3。將15 批樣品的指紋圖譜均導入前述相似度評價系統計算相似度，結果有10 批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度大于0.9，故暫定白英藥材飲片指紋圖譜相似度不得低于0.9。詳見表2。

表2 15批白英藥材飲片相似度評價結果Tab.2 Results of similarity evaluation of 15 batches of Herba Solani Lyrati Decoction Pieces

圖2 15批白英藥材飲片超高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 UPLC chromatogram superimposed fingerprint of 15 batches of Herba Solani Lyrati Decoction Pieces

圖3 白英藥材飲片超高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of UPLC chromatograms of Herba Solani Lyrati Decoction Pieces

2.3.4 共有峰標定

根據15 批樣品的指紋圖譜測定結果，共標定8 個共有峰。經過與對照品比對并結合圖譜，確認其中3 個所對應的化學成分分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸。

3 討論

白英藥材飲片的主要活性成分包括有機酸、生物堿等。預試驗中考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等提取溶劑對樣品共有成分的影響，最終確定提取溶劑為50%甲醇。同時考察了超聲和回流提取方法，結果兩者的提取效果無明顯差異，主要色譜峰的峰面積均接近，采用超聲提取制備供試品溶液，更快捷、方便，故選擇前者。本研究中，15批樣品浸出物含量平均值為9.63%，浸出物限度按測定結果平均值的80%計算，暫定浸出物含量不得低于8%。15 批樣品的綠原酸含量均值為0.057%，含量限度按測定結果均值的±30%計算，暫定綠原酸含量不得少于0.040%。并確定了指紋圖譜中的8個共有峰，其中，3個對應的化學成分分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，另外5個共有峰的成分有待進一步確認。并確定了相似度不低于0.9作為白英藥材飲片的質量標準之一。

綜上所述，本研究中所建立的質量標準，浸出物含量限度設置合理，主要有效成分綠原酸含量測定方法重復性好，專屬性強，含量限度設置合理，指紋圖譜專屬性強、特征性好，可為白英藥材飲片及其制劑的質量控制提供參考。