小兒參術健脾丸質量標準提升研究

姜 旭，趙躍東，梁娟娟，楊曉寧△，董媛媛，孫路萍，朱 平

（1. 北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100085； 2. 山西振東五和堂制藥有限公司，山西 長治 046108）

小兒參術健脾丸現收錄于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第5 冊）》（WS3- B - 0892- 91），由黨參、白術、山楂、陳皮等13 味中藥材組方，具有開胃、健脾、止瀉功效，用于小兒脾胃虛弱、消化不良、面黃肌瘦、精神不振的治療。現有質量標準中僅有其性狀和顯微鑒別，且缺乏藥味歸屬的說明，質量可控性差。為響應國家藥品監督管理局提高兒童藥質量的要求，本研究中對制劑中單味藥材進行了顯微鑒別，完成藥味確認與歸屬，建立了部分藥味的薄層色譜鑒別（TLC）法，增加了橙皮苷定量測定的高效液相色譜（HPLC）法，進而提升小兒參術健脾丸的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 型液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DM750型電子顯微鏡（德國Leica 公司）；TLC Vi?suaLizer 型薄層色譜數碼成像系統（瑞士Camag 公司）；KQ - 500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME - 204 型電子分析天平（梅特勒- 托利多國際貿易<上海>有限公司）。

1.2 試藥

小兒參術健脾丸（山西振東五和堂制藥有限公司，批號分別為20200809，20200914，20200915）；橙皮苷對照品（批號為110721-202019，含量95.3%），白術對照藥材（批號為120925-202013），陳皮對照藥材（批號為120969 - 202011），山楂對照藥材（批號為121138 -201206），甘草對照藥材（批號為120904 - 202021），均購自中國食品藥品檢定研究院；茯苓（安徽家和中藥科技股份有限公司，批號為Y2010018）；黨參（山西振東道地藥材開發有限公司，批號為Y2010015）；山楂（陽城縣益農土地流轉農民專業合作社，批號為Y2006003-6）；（土炒）白扁豆（安徽美譽中藥飲片有限公司，批號Y2006018-1）；（麩炒）六神曲（安徽守信中藥科技有限公司，批號為Y2009004）；（蜜炙）甘草（河北智嘉藥業有限公司，批號為Y2007036）；硅膠G 薄層板（煙臺新誠硅膠材料有限公司）、聚酰胺薄層板（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠），規格均為10 cm×10 cm；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取樣品適量，用溫水溶解，去除紅糖和蜂蜜，取干燥后藥渣，置顯微鏡下觀察，并與對照藥材粉末顯微特征進行比對。不規則分枝狀團塊無色，遇水合氯醛液溶化；茯苓菌絲無色或淡棕色，直徑為4～6μm；黨參聯結乳管直徑為12～15 μm，含細小顆粒狀物；山楂果皮石細胞單個散在或少數成群，淡紫紅色、紅色或黃棕色，類圓形或多角形；白扁豆種皮柵狀細胞長80～150μm；甘草纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。詳見圖1。

圖1 顯微特征圖Fig.1 Microscopic identification

2.2 TLC 鑒別

白術：取樣品10 丸，剪碎，加乙醚50 mL，回流提取1 h，濾過，藥渣備用，濾液濃縮蒸干，加0.5 mL 乙酸乙酯溶解，即得供試品溶液。取白術對照藥材0.5 g，精密稱定，加乙醚20 mL，超聲（功率500 W、頻率40 kHz，下同）處理15 min，濾過，濾液濃縮蒸干，加1 mL 乙酸乙酯溶解，即得對照藥材溶液［1］。按小兒參術健脾丸處方和工藝制備缺白術的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（10∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視［2］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 A。

圖2 薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatograms

山楂：取山楂對照藥材0.5 g，精密稱定，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，即得對照藥材溶液。按小兒參術健脾丸處方和工藝制備缺山楂的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述溶液及白術鑒別項下供試品溶液各5μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20∶5∶8∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視［2-3］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 B。

陳皮：取白術鑒別項下備用藥渣，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加水20 mL使溶解，通過D101 型大孔吸附樹脂（內徑為1.5 cm，柱高為20 cm），依次用水、30%乙醇、50%乙醇各100 mL洗脫，收集30%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供試品溶液。收集50%乙醇洗脫液，備用。取陳皮對照藥材0.5 g，精密稱定，加甲醇15 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得對照藥材溶液。按小兒參術健脾丸處方和工藝制備缺陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇（5∶1∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［2］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 C。

甘草：取陳皮鑒別項下備用50%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對照藥材0.5 g，精密稱定，加甲醇15 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。按小兒參術健脾丸處方和工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，在紫外光燈（365 nm）下檢視［2，4］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 D。

2.3 橙皮苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（18∶82，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：283 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20μg的對照品溶液。取樣品（剪碎，混勻）約1 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足缺失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按小兒參術健脾丸處方及制備工藝制備缺陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

系統適用性試驗與專屬性試驗：精密吸取2.3.2項下3 種溶液各10μL，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相應位置有色譜峰，理論板數按橙皮苷峰計應不低于2 000［5-7］，分離度均大于1.5，陰性對照無干擾。詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

線性關系考察：取2.3.2 項下對照品溶液適量，加甲醇制成質量濃度為100μg/mL 的溶液，倍比稀釋，制成不同質量濃度的系列對照品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標，以橙皮苷峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 0.305X- 0.014 4（r=0.999 9）。結果表明，橙皮苷質量濃度在4.898 4～48.984 2μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.3.2 項下供試品溶液適量，按2.3.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果橙皮苷峰面積的RSD為0.23%（n= 6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.3.2項下對照品溶液和供試品溶液各適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h 時按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果橙皮苷峰面積的RSD分別為0.65%和0.48%（n= 6），表明對照品溶液和供試品溶液室溫下放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取樣品適量，精密稱定，共6 份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算橙皮苷含量。結果的RSD為1.25%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的樣品適量，精密稱定，平行9份，加入一定質量濃度的對照品溶液，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.3.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，結果3批樣品中橙皮苷含量分別為1.20，1.19，1.20 mg/g。

3 討論

顯微鑒別法是中藥原粉入藥常用質量控制手段之一，本研究中通過鑒別小兒參術健脾丸的顯微特征，對現有質量標準中的顯微特征進行確認和歸屬，發現原有質量標準中柵狀細胞結構不僅在白扁豆中存在，也在六神曲（含赤小豆粗粉）中存在，其顯微結構專屬性不強，有待討論和確定。中藥原粉入藥的顯微鑒別有助于避免含相同化學成分含量控制的中藥材混用，保證藥品的質量。

TLC法和HPLC法具有操作方便、檢測速度快、靈敏度高等特點，廣泛應用于藥物分析［8-15］。優化上述2種方法的條件后，建立了小兒參術健脾丸中白術、陳皮、山楂、甘草的TLC 鑒別方法和橙皮苷的含量測定方法。通過同一份樣品同一制備方法中的不同產物，即可完成處方中4 個藥味的TLC 鑒別，操作簡單可行，有效節約了樣品用量，減少了有機溶劑種類，簡化了煩瑣的操作。結果4種藥材薄層特征明顯，分離度高，陰性對照無干擾，專屬性強。建立的橙皮苷含量測定方法，精密度、重復性佳，回收率高。

綜上所述，本研究中所建立的方法可靠，重復性好，可為小兒參術健脾丸質量標準的修訂提供參考。