高效液相色譜法同時檢測彩妝類化妝品中8 種著色劑

杜文亞，張曉東

（內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古 呼和浩特 010010）

化妝品中使用的染料多為偶氮類染料或以苯、蒽等為原料，其安全性受到關注。《化妝品安全技術規范（2015 年版）》（簡稱《規范》）雖明確提供了禁/ 準用著色劑目錄，但準用著色劑目錄中，多數著色劑無限量要求或僅原料或雜質有限量要求。化妝品中著色劑的檢測多采用高效液相色譜（HPLC）法［1-7］、高效液相色譜串聯質譜法［8-12］等。根據國家藥品監督管理局發布的《化妝品禁用原料目錄》［13］，苯胺黃、溶劑黃3、直接棕95、堿性紅2 均為禁用著色劑；根據《規范》，堿性藍26、酸性紫9、酸性橙11、食品紅14 均為準用著色劑，但均無限量要求，且僅酸性橙11 和食品紅14 在其他限制和要求項下規定了原料或雜質質量要求。本研究中參考《規范》，并結合8 種著色劑的色譜行為分為2 組，第1 組包括堿性紅2、酸性紫9、溶劑黃3、苯胺黃、堿性藍26，第2 組包括酸性橙11、直接棕95、食品紅14，采用HPLC 法檢測彩妝類化妝品中8 種著色劑，旨在為彩妝類化妝品的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS 105型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；IKAMS3 型渦旋混合器（德國IKA 公司）；3-18KS 型臺式高速離心機（德國Sigma 公司）；KS - 500E 型超聲波清洗機（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

40批市售彩妝類化妝品樣品（眼影或腮紅18批、口紅22 批），均購自內蒙古自治區；鮮果植物蘋果潤唇膏空白樣品（蠟基質類，基質中含合成蠟、地蠟或微晶蠟，韓國自然樂園化妝品株式會社有限公司，批號為2RLY0805）；Dior單色眼影空白樣品（粉基質類，基質中含滑石粉或玉米粉，克麗絲汀迪奧商業< 上海> 有限公司，批號為1D03）；苯胺黃對照品（批號為20227）、溶劑黃3 對照品（批號為20251）、直接棕95 對照品（批號為22346）、堿性藍26 對照品（批號為26489）、酸性紫9對照品（批號為20105）、酸性橙11 對照品（批號為21772），食品紅14 對照品（批號為22583）、堿性紅2 對照品（批號為20498），均購自北京曼哈格生物科技有限公司，含量均大于90.0%；磷酸為優級純，甲醇、乙醇、四氫呋喃均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）；流速：1.0 mL/min；二極管陣列檢測器檢測；目標成分的梯度洗脫程序，第1 組為，0 ~ 25 min 時40%B →90%B，25 ~ 26 min 時90%B →40%B，26 ~ 35 min 時40%B，檢測波長分別為380 nm（苯胺黃、溶劑黃3）、530 nm（堿性紅2、酸性紫9）、600 nm（堿性藍26），第2 組為，0 ~ 10 min 時73%B →83%B，10~25 min時83%B →73%B，25~35 min時73%B，檢測波長分別為230 nm（酸性橙11和直接棕95）、540 nm（食品紅14）；柱溫：25 ℃；進樣量：5μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取8 種對照品各10 mg，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中。酸性紫9、溶劑黃3 分別加乙醇、甲醇-水-四氫呋喃（1∶1∶1，V/V/V）溶解并定容，其余6 種均用甲醇- 水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，制成質量濃度均為1 mg/mL 的單一對照品貯備液；各精密吸取1.0 mL，按上述分組分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋并定容，搖勻，制成各成分質量濃度均為100 μg/ mL 的混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ。

供試品溶液：1）粉基質類供試品溶液。取樣品0.2 g，精密稱定，置10 mL 離心管中，加甲醇-水-四氫呋喃（1∶1∶2，V/V/V）溶解并定容，渦旋1 min，充分混勻，超聲（功率120 W、頻率40 kHz，下同）提取20 min，10 000 r/min離心10 min，經0.45μm 微孔濾膜濾過，即得。2）蠟基質類供試品溶液。取樣品0.2 g，精密稱定，置10 mL 離心管中，水浴（80 ℃）加熱至樣品融化，加甲醇-水-四氫呋喃（1∶1∶2，V/V/V）溶解并定容，渦旋1 min，充分混勻，50 ℃超聲提取20 min，10 000 r/min 離心10 min，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別精密吸取混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果各待測組分分離度均大于1.5，峰形佳，理論板數按待測成分峰計均大于18 000。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取上述混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，分別加甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋、定容、搖勻，分別制備系列混合對照品溶液。取適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分的質量濃度（X，mg/ L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系及檢測限與定量限考察結果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

檢測限與定量限考察：取2 種不同基質的空白樣品適量，分別加入混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ各0.01 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3 和10時的待測成分質量濃度分別記作檢測限和定量限。詳見表1。

精密度試驗：精密量取2.2 項下混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果堿性紅2、酸性紫9、溶劑黃3、苯胺黃、堿性藍26、酸性橙11、直接棕95、食品紅14 峰面積的RSD分別為0.43%，0.31%，0.40%，0.42%，0.19%，0.20%，0.12%，0.09%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ各適量，分別于室溫下放置0 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果直接棕95 和食品紅14 在3 d 內穩定，之后逐漸降解；其余6 種著色劑在7 d 內均穩定，RSD均小于2.0%（n=7）。

提取回收試驗：取2 種不同基質的空白樣品各約0.2 g，精密稱定，各9 份，分別置10 mL 離心管內，分別精密加入2.2 項下2 種混合對照品溶液0.04，0.2，0.4 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算平均提取回收率。結果見表2。

表2 提取回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取40 批樣品各0.2 g，平行2 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果僅1批眼影樣品（批號為ES 1326K）檢出酸性紫9，含量為81.28 mg/kg，其余樣品中均未檢測出前述8種著色劑。

3 討論

3.1 色譜條件優化

流動相：分別采用了水-甲醇、水-乙腈、0.1%磷酸水溶液- 甲醇、0.1%磷酸水溶液- 乙腈、乙酸銨溶液（25 mmol/L）-甲醇、乙酸銨溶液（25 mmol/L）-乙腈、0.5%磷酸水溶液-甲醇、0.5%磷酸水溶液-乙腈為流動相。結果采用0.1%磷酸水溶液-甲醇進行梯度洗脫時，各目標組分均響應較高、峰形佳，且與基線分離良好。這是因為甲醇可兼顧不同極性化合物的洗脫，0.1%磷酸水溶液可提高響應，方便各成分的定性和定量檢測。但該體系同時檢測8 種著色劑時，直接棕95和食品紅14 對流動相比例改變較敏感，流動相比例的微小變化導致其保留時間較大變化，易與其他組分交疊并同時出峰；且酸性橙11 與堿性紅2 因保留時間接近很難較好地分離。故最終將8 種組分分為2 組，通過調節流動相A、B 的比例，獲得最佳的保留效果和分離效果。

色譜柱：預試驗中考察了4 種不同品牌的C18柱［Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（柱1）、TechMate C18- ST 柱（柱2）、OMNI Bond Hubble C18柱（柱3）、Welch AQ - C18柱（柱4），規格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm］。結果8 種著色劑在柱1 和柱2 上均不能同時達到較好的保留效果，堿性藍26 在柱1 上受雜峰干擾嚴重，食品紅14在柱1上響應低、峰形欠佳；溶劑黃3在柱2 上無保留行為。待測成分在柱3 和柱4 上均有較好的響應及分離效果，但柱4 的耐酸性更好，結合流動相綜合考慮，最終選擇柱4。

柱溫：預試驗中同時考察了不同柱溫（15，25，35，45 ℃）對8 種著色劑色譜保留行為的影響。結果柱溫為25 ℃時，各組分的分離度最佳。

檢測波長：采用二極管陣列檢測器對8種對照品溶液進行了全波長掃描。結果第1 組檢測波長以380 nm（苯胺黃和溶劑黃3）、530 nm（堿性紅2和酸性紫9）、600 nm（堿性藍26），第2組以230 nm（酸性橙11和直接棕95）、540 nm（食品紅14）為佳。

3.2 樣品前處理條件優化

提取溶劑：參考文獻［1，3-7］及8種著色劑在不同溶劑中的溶解情況，選取甲醇、四氫呋喃、甲醇-水（1∶1，V/V）、甲醇-0.5 mol/L 乙酸銨溶液-四氫呋喃（1∶1∶1，V/V/V）、甲醇-水-四氫呋喃（1∶1∶1，V/V/V）為提取溶劑，考察對空白加標樣品中目標成分回收率的影響。結果選取甲醇-0.5 mol/L 乙酸銨溶液-四氫呋喃時，食品紅14 峰分解為2 個相鄰峰；選擇甲醇和甲醇-水（1∶1，V/V）時，基質效應干擾嚴重，各成分峰形較差且回收率較低；四氫呋喃可明顯改善回收率較低的問題，但基質效應仍存在；甲醇- 水- 四氫呋喃，基質效應明顯改善，且提取較完全，回收率較高，峰形滿足要求。進一步考察該體系中甲醇、水、四氫呋喃不同體積比（1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶5）對回收率的影響。結果選取甲醇- 水- 四氫呋喃（1∶1∶1，V/V/V）時，多數目標成分回收率良好（80.56%～110.12%）；且隨著四氫呋喃比例的增加，食品紅14、直接棕95、溶劑黃3 和酸性橙11 的回收率均提高。當甲醇-水-四氫呋喃的體積比為1∶1∶2 時，目標成分的回收效果均達到最佳（86.83%～108.65%）；當四氫呋喃比例再增加時，各成分回收率變化不明顯，故最終選取甲醇- 水- 四氫呋喃（1∶1∶2，V/V/V）為提取溶劑。

提取條件：蠟基質類化妝品若直接加入優化的提取溶劑，樣品不能充分分散溶解，故需將樣品置離心管中水浴（80 ℃）加熱至融化。樣品僅靠與提取溶劑渦旋振蕩不能保證提取完全，故還需考察超聲的溫度和時間。本研究結果顯示，在25 ℃和35 ℃下超聲，蠟基質類樣品會凝固，不利于提取完全；50 ℃時，樣品基質保持良好的分散性和流動性，從而能與提取溶劑充分且有效地接觸。粉基質類樣品不受超聲溫度的影響。設置不同超聲時間時對2 種空白基質加標樣品回收率的影響均不明顯，故選擇最短的20 min。本研究中同時考察了同為0.45μm 厚的尼龍濾膜和聚四氟乙烯濾膜。結果2種空白基質樣品的回收率均較好。

3.3 方法評價

本研究中建立的HPLC 法操作簡單，結果準確可靠，可用于同時檢測彩妝類化妝品中8 種著色劑。但化妝品配方復雜，膏劑和霜劑采用該方法仍無法實現有效分離及精確定性、定量，且僅以保留時間為定性指標，可能存在假陽性和假陰性情況，故后續需建立高效液相色譜串聯質譜法進一步分析，為我國彩妝類化妝品中著色劑的監管和產品質量控制提供參考。