液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)消毒產(chǎn)品中63 種激素

吳芳花，具笑平，吳志國，陳騰輝

（廣東省河源市藥品檢驗(yàn)所，廣東 河源 517025）

消毒產(chǎn)品不是藥品，且嚴(yán)格區(qū)別于藥品。消毒產(chǎn)品無治療疾病的作用，故成分中禁止使用激素等物料，非法添加激素可增強(qiáng)效果，使消費(fèi)者誤以為可避免藥物副作用又有療效或是直接誤當(dāng)藥品使用，導(dǎo)致激素長(zhǎng)期或過量使用，耽誤病情或引發(fā)如“大頭娃娃”等問題。目前，雖有研究采用液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)消毒產(chǎn)品，但研究覆蓋的激素成分較少，檢測(cè)的品種類別單一，用時(shí)較長(zhǎng)，專屬性較差，隨著非法激素成分種類的增加，簡(jiǎn)單或成分單一的檢測(cè)方法已難以滿足監(jiān)管需求，急需改進(jìn)。鑒于此，本研究中以常見的63 種激素為分析目標(biāo)，建立了系統(tǒng)、有效、快速且能在不同基質(zhì)消毒產(chǎn)品中同時(shí)篩查和驗(yàn)證63 種激素成分的檢測(cè)方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LCMS - 8050 型液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津<上海>實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.1 mg）；Milli - Direct16 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 公司）；CT14RD型臺(tái)式高速離心機(jī)（天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)置<上海>有限公司）；DTC-15F 型超聲波清洗儀（湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司）；MX - S 型賽洛捷克渦旋混合儀（上海芃奇科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

混合激素對(duì)照品溶液A（32 種激素對(duì)照品混合，批號(hào)為S070721），混合激素對(duì)照品溶液B（30 種激素對(duì)照品混合，批號(hào)為S070383），均購自邁迪嘉<天津>科技有限公司，質(zhì)量濃度均為100μg/mL；曲安西龍對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100333-201102）；N-丙基乙二胺（PSA，批號(hào)為MO0220526106），十八烷基鍵合硅膠（C18，批號(hào)為MO0220526110），均購自深圳逗點(diǎn)生物科技有限公司；無水硫酸鎂（阿拉丁試劑<上海> 有限公司，批號(hào)為MO0220526110）；氯化鈉（批號(hào)為20201107），亞鐵氰化鉀溶液（批號(hào)為20161202），均購自廣州化學(xué)試劑廠；乙酸鋅（廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究中心，批號(hào)為20170621）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。實(shí)測(cè)樣品40 批，來自市場(chǎng)隨機(jī)或針對(duì)性采購。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack XR-ODS ⅡC18柱（100 mm ×2.1 mm，2μm）；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～4 min 時(shí)25%B，4～8 min 時(shí)25%B →33%B，8～10.5 min 時(shí)33%B →38%B，10.5～14.5 min時(shí)38%B →60%B，14.5～15 min 時(shí)60%B →95%B，15～17.5 min 時(shí)95%B，17.5～17.6 min 時(shí)95%B →25%B，17.6～22.5 min 時(shí)25%B）；流速：0.3 mL/ min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：3μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1（限于篇幅，僅選取其中較有代表性的20 種激素成分的相關(guān)參數(shù)；其中雌三醇、雌二醇采用負(fù)離子MRM，其余待測(cè)成分為正離子MRM；*離子為定量離子）。

表1 激素類成分監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)（部分）Tab.1 Partial monitoring ion pairs of hormones and related parameters

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取曲安西龍對(duì)照品約10.0 mg，精密稱定，加乙腈超聲（功率446 W、頻率40 kHz，下同）處理20 min，制成質(zhì)量濃度為100 μg/ mL 的曲安西龍對(duì)照品貯備液。精密移取混合激素對(duì)照品溶液A，B 及曲安西龍對(duì)照品貯備液各1.0 mL，置20 mL 容量瓶中，加乙腈定容，得質(zhì)量濃度均為5 μg/mL 的混合對(duì)照品貯備液；精密量取5.0 mL，置25 mL容量瓶中，加乙腈定容，即得質(zhì)量濃度均為1μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：1）液體制劑、凝膠制劑類。取樣品（稱前混勻）約0.2 g，精密稱定，置10 mL 塑料離心管中，加入少量乙腈，渦旋振蕩30 s 至混勻，加入乙腈至近刻度，超聲提取20 min，靜置至室溫，用乙腈定容，搖勻，8 000 r/ min 離心10 min，濾過（當(dāng)樣品中地塞米松或倍他米松含量過高導(dǎo)致兩峰難分開時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步適當(dāng)稀釋，最后可取上清液適量加50%乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm濾膜濾過，即得。2）乳膏制劑類。同法取樣，置15 mL 離心管中，加入2 mL 飽和氯化鈉溶液，充分渦旋，精密加入乙腈5.0 mL，再次充分渦旋。超聲處理15 min后混勻，于冰箱0～4 ℃冷藏1 h，然后8 000 r/min離心15 min，取上清液置15 mL 凈化管中（含PSA、C18各0.2 g，無水硫酸鎂0.5 g）充分渦旋3 min，同前冷藏、離心，取上清液置10 mL 離心管中，加25%乙腈2～3 mL，再加10%亞鐵氰化鉀溶液及20%乙酸鋅溶液各0.2 mL，再加25%乙腈定容，同法冷藏，8 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：1）液體制劑、凝膠制劑類。取與待測(cè)樣品基質(zhì)類型相同空白樣品0.2 g，共5 份，精密稱定，置10 mL 離心管中，得陰性對(duì)照品溶液；分別加入混合對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法處理，然后用50%乙腈溶液配制成質(zhì)量濃度分別為10，25，50，80，100 ng/ mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2）乳膏制劑類。同法取樣，得陰性對(duì)照品溶液。分別加入混合對(duì)照品貯備液適量，按供試品溶液制備方法處理，配制成質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80，100 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：取液體制劑、凝膠制劑、乳膏制劑的陰性樣品各0.2 g，精密稱定，置10 mL 具塞比色管中，加混合對(duì)照品溶液0.10 mL，制得相應(yīng)加標(biāo)溶液，濾過，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果3種加標(biāo)樣品溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處均出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，離子豐度比均在允許誤差范圍內(nèi)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1。

圖1 MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，各待測(cè)成分質(zhì)量濃度，液體制劑、凝膠制劑在10～100 ng/ mL，乳膏制劑在20～100 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。詳見表2。

表2 方法學(xué)考察及提取回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the methodological investigation and extraction recovery test

檢測(cè)限與定量限考察：取3種空白各適量，分別添加混合對(duì)照品溶液，用50%乙腈倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以定量離子信噪比為3和10時(shí)的含量作為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果63種待測(cè)成分在液體制劑、凝膠制劑、乳膏制劑中的檢測(cè)限分別為0.025～0.030μg/g，0.029～0.031 μg/ g，0.028～0.033 μg/ g，定量限分別為0.078～0.110 μg/ g，0.080～0.123 μg/ g，0.083～0.124μg/g。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%乙腈定容，制成質(zhì)量濃度為50 ng/ mL 的混合對(duì)照品溶液。按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果63 種激素定量離子對(duì)質(zhì)譜峰峰面積的RSD為0.414%～6.622%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取3 種不同基質(zhì)陰性樣品適量，分別于室溫下放置0，1，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.52%～10.23%（n=7），表明室溫下上述陰性樣品放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取穩(wěn)定性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液各6 份，分別加入混合對(duì)照品溶液，混勻，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果液體制劑的陰性樣品峰面積的RSD為3.82%～13.51%，凝膠制劑的為2.31%～13.22%，乳膏制劑的為5.20%～10.02%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

提取回收試驗(yàn)：取3 種不同基質(zhì)陰性樣品各適量，加入適量混合對(duì)照品溶液，混勻，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表2（因篇幅有限，僅列舉液體制劑）。

2.4 樣品含量測(cè)定

取40 批樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算非法添加激素的含量。結(jié)果12 批（30.00%）樣品檢出非法添加激素成分。其中2批同時(shí)添加地塞米松及地塞米松醋酸酯，含量分別為0.04 mg/g、0.06 mg/g及0.59 mg/g、0.83 mg/ g；8 批添加氯倍他索丙酸酯，含量分別為0.58，0.82，0.06，0.10，1.25，4.56，3.12，3.60 mg / g；2 批同時(shí)添加地塞米松、地塞米松醋酸酯、氯倍他索丙酸酯，含量分別為0.007 mg/g、3.07 mg/g、0.004 mg/g及0.005 mg/g、2.43 mg/g、0.002 mg/g。

3 討論

3.1 樣品提取方法優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中采用實(shí)驗(yàn)室常用試劑（如甲醇、乙醇、乙腈等）作為提取液，乙腈溶解性強(qiáng)，回收率較高，因此選擇乙腈作為液體和凝膠制劑樣品的提取溶劑。而乳膏類樣品由于基質(zhì)中含有大量的油脂、糖和表面活性物質(zhì)，單純用乙腈提取雖能提取出激素類成分，但重復(fù)性欠佳，尤其是有機(jī)相類，能滿足單純的定性要求，但難以精確定量。通過QuEChERS 提取技術(shù)［1-4］+ 亞鐵氰化鉀溶液- 乙酸鋅沉淀法凈化樣品，并通過各種比例和兩項(xiàng)技術(shù)順序調(diào)整進(jìn)行探索，最終形成本研究中的提取方法，回收率和重復(fù)性大幅提高。同時(shí)，通過預(yù)試驗(yàn)研究加入亞鐵氰化鉀溶液- 乙酸鋅溶液和QuEChERS系統(tǒng)凈化的先后順序，確定最后加亞鐵氰化鉀溶液-乙酸鋅溶液，使白色絮狀物在冷凍離心后能沉淀在試管底部，樣品溶液取樣不受影響，能精準(zhǔn)定量，有效解決某些樣品在加入原始流動(dòng)相后產(chǎn)生白色絮狀物且冷凍離心仍無法去除最終影響定量結(jié)果的問題。

3.2 樣品基質(zhì)效應(yīng)

消毒產(chǎn)品基質(zhì)較復(fù)雜，尤其是乳膏制劑，與分析物一起流出的組分直接影響電噴霧離子化效果并可增強(qiáng)或減弱檢測(cè)信號(hào)，為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)待測(cè)成分測(cè)定的影響，在多次試驗(yàn)，并查閱文獻(xiàn)［4-16］及國家藥品監(jiān)督管理局《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 版）》后，采用補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法：以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加相同基質(zhì)空白樣品用與樣品相同的前處理方法得到的供試液，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的校正。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法有效解決了本類樣品基質(zhì)干擾定量分析，特別是含量極低的待測(cè)成分含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性問題，為應(yīng)對(duì)日后復(fù)雜多變的樣品基質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果提供了良好的解決方案。

3.3 與傳統(tǒng)方法比較

本研究中采用簡(jiǎn)單試劑和直接提取的方法，即可對(duì)各種不同基質(zhì)樣品同時(shí)進(jìn)行63種激素成分的定性和定量檢測(cè)；同時(shí)通過將流動(dòng)相由原來常用的甲醇改為乙腈，使待測(cè)成分中的同分異構(gòu)體能較好地分離，尤其對(duì)一直難以分離的地塞米松與倍他米松有顯著效果。相對(duì)傳統(tǒng)操作煩瑣的化學(xué)反應(yīng)、薄層色譜、高效液相色譜反復(fù)驗(yàn)證分析法，很好地節(jié)約了檢測(cè)成本，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間；同時(shí)也為檢測(cè)各種非法添加藥物提供了思路和良好的鑒定方法。