海帶配子體低溫冷凍保存研究

錢瑞，陳書秀，羅世菊，武瑞娜，王利芹，賽珊

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻與海參技術創新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東 煙臺 264003）

大型海藻種質保存技術，按照保存溫度可以分2 大類：傳統的低溫弱光保存（一般為8～12 ℃）和以低溫（4 ℃）、冷凍（-40 ℃）、低溫真空冷凍干燥和超低溫（-196 ℃）為主的冷凍保存[1]。關于海帶種質保存方式，0～10 ℃低溫弱光液體保存配子體，是公認的長期保存海帶種質的最佳方式，目前我國的海帶種質絕大多數是以這種方式保存。但該保存方式存在明顯的不足，如保存期間，需定期更換培養液，工作量大、操作頻繁，增加了種質污染及混雜的概率，同時限制了保存的規模和效率，保種過程中易出現細胞形態異常、單性生殖等現象[2-3]。-196 ℃液氮冷凍保存，可使配子體的代謝完全停止，實現配子體的永久保存，但液氮冷凍保存3 種常用方法（程序降溫法、逐級冷凍法、包埋脫水法）均存在很大局限性，其中程序降溫法對儀器設備要求高，包埋脫水法對脫水速率等操作要求極高，且3 種方法均需在液氮中進行，保存次數及保存量大受限制，后續保存成本極高[4-8]。

普通低溫冷凍保存，相對于超低溫冷凍保存更方便可行。羅世菊等[9]發明了一種海帶配子體低溫冷凍保存方法，將海帶配子體加入預冷的10%DMSO 保護液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低溫冰箱冷凍，可保存5～10 年。文獻[1]研究發現，-40 ℃低溫，即可抑制生物細胞的生化活動，排除遺傳性狀的變異，可用于多數海藻種質保存。現采用不同的溫度（-80 ℃、-40 ℃、-20 ℃），對不同品種的海帶配子體細胞段或細胞簇進行低溫冷凍保存，比較不同溫度對海帶配子體生長發育的影響，以期為海帶低溫冷凍保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

設置3 個不同的溫度組A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 個對照組D（未凍存配子體細胞），對不同品種的海帶配子體細胞段或細胞簇進行低溫冷凍保存，15 d 后取出，進行復蘇培養和發育培養，統計配子體細胞存活率及發育率。

1.2 材料

采用實驗室低溫弱光保存的雌雄配子體單克隆系，品種為901、東方6 號、東方7 號。保存條件為：溫度10 ℃，光強10 μmol/m2·s，光時24 h/d。用于低溫冷凍的配子體細胞為僅含2～5 個細胞的片段或多細胞簇。

1.2.1 僅含2～5 個細胞片段的獲取方法

選取色素正常、狀態良好、無污染的配子體材料，玻片壓磨后，經孔徑為0.048 mm 篩絹過濾，獲得配子體細胞懸濁液，其中大多數為含有2～5 個細胞的小型片段。將一定量的懸濁液平鋪于培養皿中，培養皿提前放置一定大小的玻片，玻片的大小以凍存管口徑為標準確定。培養皿放置在10 ℃、10 μmol/m2·s 條件下恢復培養1 周后，附著于小玻片上的細胞段，用于低溫冷凍。

1.2.2 多細胞簇的獲取方法

選取低溫弱光條件下保存的呈簇狀的配子體克隆團，稱取鮮質量0.010 g，放入凍存管直接凍存。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷凍保護液配制

采用煮沸冷卻的海水為基礎液，配制10%體積濃度的二甲基亞砜冷凍保護液，置于0～4 ℃冰箱存放，備用。

1.3.2 凍存方法

所有凍存管分別加入1 mL 冷凍保護液并編號，放入-20 ℃冰柜預凍24 h。后取出，再分別加入1.3.1 中的10%DMSO 保護液0.8 mL。用鑷子夾取1.2.1 和1.2.2 中獲得的不同細胞狀態的配子體材料，分別放入不同編號的凍存管中，擰緊蓋子。所有凍存管放入0～4 ℃低溫冷藏箱平衡30 min。平衡結束，將處理好的配子體材料分別放入-80，-40，-20 ℃低溫凍存。

1.3.3 解凍和保護劑的去除

將凍存15 d 的凍存管放入40 ℃的恒溫水浴鍋中，迅速震蕩直至最后一個冰晶消失，用鑷子將附有配子體細胞段的小玻片或多細胞簇取出，分別放入培養皿或錐形瓶中，加預冷低溫培養液，多次換水沖洗，去除冷凍保護劑。

1.3.4 存活率的測定

將經過冷凍保護處理解凍后的配子體細胞，接種于新鮮培養基中，附有細胞段的玻片接種于培養皿中，細胞簇接種于100 mL 錐形瓶中。均放置在10 ℃、光強10 μmol/m·2s、光時24 h/d 條件下培養。

細胞段存活率的計算：冷凍保存之前每個玻片隨機觀察10 個100×視野，統計每個視野中的總細胞段數，求平均值作為凍存總細胞段數。解凍復蘇后，每周鏡檢觀察配子體生長狀態，第30 天，每個玻片上隨機觀察10 個100×視野，統計每個視野中的存活細胞段數，求平均值，即每個試驗條件共測量30 個數據（n=30）。計算公式如下：

細胞段存活率（%）=存活細胞段數/凍存總細胞段數×100%。

細胞簇存活率的計算：解凍復蘇后7 d，每個錐形瓶中的配子體細胞簇，用移液槍吸取微量的海帶配子體于載玻片上，用牙簽將絲狀體盡量分開，在載玻片上滴1～2 滴海水，用鑷子蓋上蓋玻片后，用吸水紙吸干周圍多余的水分，即制作好配子體樣本。將樣本在顯微鏡下觀察，并用數碼相機記錄配子體的生長狀態。采用Image J 進行數據測量，測量每個視野（100×）中細胞總面積與存活細胞總面積，每個配子體樣品測量10 個數據，即每個試驗條件共測量30 個數據（n=30）。存活率計算公式：

細胞簇成活率（%）=存活細胞面積/細胞總面積×100%。

1.3.5 凍存的海帶配子體發育試驗

將凍存復蘇后培養6 個月的同品種雌、雄配子體，分別磨碎后經孔徑為0.048 mm 篩絹過濾，形成一定濃度的細胞懸濁液，相同密度的雌雄配子體按照體積比2∶1 混合均勻。取適量的雌雄混合懸濁液平鋪于培養皿中，放置在光照強度20 μmol/m2·s 、光周期10L∶14D、溫度10 ℃條件下培養。每3～4 d更換1 次培養液并鏡檢，觀察其生長發育情況，試驗周期30 d。

配子體發育率的計算：每個培養皿隨機觀察10 個100×視野，分別統計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數，按卵囊形成數、排卵數和孢子體數之和占總細胞數的百分比計算發育率。

1.4 數據處理

用SPSS19.0 軟件對存活率及發育率進行單因子方差分析、多重比較，P＜0.05，表示差異顯著。用Excel 轉件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同凍存溫度對海帶配子體細胞段存活率及細胞恢復生長的影響

不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細胞段存活率的影響結果方差分析見表1。由表1 可見，不同凍存溫度、海帶品種及雌雄差異對海帶配子體細胞段存活率有顯著的影響（P＜0.05），但其中兩者或3 者的交互作用對海帶配子體細胞段存活率無顯著影響（P＞0.05）。

表1 不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細胞段存活率的影響結果方差分析

不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細胞段存活率的影響見圖1（a）（b）。由圖1 可見，3 個品種的海帶雌配子體細胞段經3 種低溫凍存后的存活率無顯著差異，存活率均低于10%。901 海帶雄配子體細胞段在-80 ℃、-40 ℃凍存后的存活率（24.73%、17.87%）顯著高于東方6 號和東方7 號雄配子體細胞段的存活率。3 個海帶品種雌雄配子體細胞段在經-20℃凍存后的存活率（0.03%～2.60%），均低于A 組和B 組（1.30%～24.73%），但其中僅901不同溫度凍存組間細胞段的存活率差異顯著，東6和東7 海帶不同溫度凍存組間細胞段存活率差異不顯著。經相同低溫冷凍的3 個海帶品種雄配子體細胞段存活率（0.33%～24.73%）均高于雌配子體（0.03%～6.77%）。

圖1 不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細胞段存活率的影響

對冷凍復蘇培養后的存活細胞段鏡檢發現，復蘇初期配子體細胞段會出現大量死亡，經30 d 培養后，存活細胞段顏色加深，開始出現分支，培養75 d后，每個存活細胞段均長成了具有大量分支的細胞簇狀體，且經不同冷凍處理的海帶配子體生長狀態無顯著差異。見圖2（a）（b）（c）。

圖2 不同溫度凍存的901♂配子體細胞段

2.2 不同凍存溫度對海帶配子體細胞簇存活率及細胞恢復生長的影響

不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細胞簇存活率的影響結果方差分析見表2。由表2 可見，不同凍存溫度及雌雄差異對海帶配子體細胞段存活率有顯著的影響（P＜0.05），但品種、兩者或三者的交互作用對海帶配子體細胞段存活率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細胞簇存活率的影響結果方差分析

不同凍存溫度對3 個品種的海帶雌雄配子體細胞簇存活率的影響見圖3（a）（b），由圖3 可見，3 個品種的海帶雌雄配子體細胞簇經-20 ℃凍存后的存活率（0.44%～1.37%）顯著低于A 組和B 組的存活率（32.00%～43.38%）。經相同低溫凍存的雌雄配子體存活率相比較，雄配子體細胞簇存活率高于雌配子體，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細胞簇存活率的影響

對冷凍復蘇培養后的存活細胞簇鏡檢觀察發現，復蘇初期配子體細胞簇會出現部分死亡，經7 d培養后，細胞簇的部分絲狀體分支舒展，細胞顏色明顯加深，細胞內色素分布均勻，見圖4（a）（b）（c）。經過90 d 的培養和觀察，確定處于該狀態的細胞即可判定為存活細胞，且經不同低溫冷凍后存活的海帶配子體細胞簇的總細胞量差異顯著，但存活細胞的生長狀態無顯著差異，見圖4（d）（e）（f）。

圖4 不同溫度凍存的901♀配子體細胞簇復蘇培養后的細胞狀態

2.3 不同凍存溫度對海帶配子體細胞發育能力的影響

從2.1 和2.2 分析結果可以看出，-20 ℃低溫冷凍保存的海帶配子體復蘇后的成活率極低，因此本試驗選用-80 ℃和-40 ℃低溫冷凍保存的材料進行發育試驗。經不同溫度冷凍后的配子體均可正常發育，且各組間的發育率無顯著差異（P＞0.05）。在發育過程中，隨著發育時間增加，各組間的發育率顯著增加，發育進程及最終發育率無顯著差異。第28 天的發育率均在70%左右，小苗率占40%～50%。與未經冷凍保存配子體相比較，其發育進程和發育率均無顯著差異，見表3。

表3 不同凍存溫度對海帶配子體發育的影響 %

3 討論

許多大型海藻如紅藻中的紫菜屬、江籬屬，褐藻中的海帶屬、馬尾屬、裙帶菜屬等，不僅是工業原料和食品，同時也是海洋生態環境修護的工具藻種，具有重要的經濟和生態價值。因此需要重視海藻資源的保護，其中一項有效的措施就是海藻種質保存，這些種質不僅可以為科學研究提供材料，也是退化海藻場修復和養殖業持續健康發展的基石[10]。根據海藻種質的生理狀態，可將種質保存方法分為培養保存和低溫保存2 類。

培養保存的原理是種質在特定條件下會不斷地營養生長而不發育，達到長期保存的目的，如果要使用，不需要復雜的復活過程[11]。培養保存方式主要包括低溫弱光和固定化。方宗熙[12]最早發明了利用低溫弱光保存海帶和裙帶菜無性繁殖系的方法，該方法保存的配子體大部分具有正常的活力，恢復正常溫度光照后，可正常發育產生孢子體。王歡等[13]將條斑紫菜（P. yezoensis）絲狀體包埋后置于4 ℃暗光下保存，其成活率可達71%，且能保持正常生長能力。鄒定輝等[14]研究發現，羊棲菜處于干出狀態（避免失水）的生殖托，在5 ℃可保存30 d，其細胞相對活力及配子體釋放能力較好。王志勇等[15]研究表明，壇紫菜葉狀體細胞，可以在半固態至固態瓊脂培養基上良好地存活、分裂和再生。陳昌生等[16]發現壇紫菜在10 ℃固體平板上可長期保存。本實驗室于20 世紀70 年代建立了海帶配子體的采集和培養技術[17-20]，隨之建立了以低溫弱光液體保存[21-25]為主的海帶種質庫，海帶種質庫建立之初保存的種質材料，最長時間可達20 年之久，每年均選擇部分配子體進行擴大培養和育苗，生長速率及發育能力與新采集的種質間無顯著差異。為了克服低溫弱光液體保存方法所存在的工作量大等缺陷，2005 年山東東方海洋科技股份有限公司和煙臺大學合作開發了海帶配子體固相保存技術[26]，并經后期多次優化，建立了一種種質無菌采集與固相培養相結合的保存方法[27]，此方法從源頭就抑制細菌污染，簡化了常規固相保存前期的無菌處理流程，保存過程中使克隆進入休眠狀態，延長保存時間。

低溫保存，即冷藏和超低溫，在此溫度下，種質基本停止了新陳代謝活動，在重新培養時，需要進行復雜的復活過程。陳昌生等[16]使用膠囊化法，在-20 ℃低溫保存壇紫菜的絲狀體，其成活率＞80%。郭金耀等[28]用包埋法使條斑紫菜脫水后，-20 ℃保存的種質成活率可達70%。陳素文等[29]將海蘿（G.furcata）風干至其鮮質量的1/4，于-80 ℃保存，其孢子附著率達70%。羅世菊等[9]將海帶配子體加入預冷的10% DMSO 保護液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低溫冰箱冷凍保存，雌配子體存活率＞50%左右，雄配子體存活率＞60%左右，可保存5～10 年。

本試驗結果表明，將配子體細胞簇加入至預冷后的10% DMSO（0 ℃）中，直接放于-80 ℃或-40 ℃冷凍保存，經復蘇培養后測得的配子體成活率達40%左右，而經同樣方法冷凍保存后的細胞段存活率僅在10%左右，因此處于細胞簇狀態的配子體細胞更適合用于-80 ℃或-40 ℃冷凍保存。若將經冷凍保護液處理過的種質材料，于-20 ℃冷凍保存，有部分品種未見存活配子體細胞，存活的海帶品種配子體成活率均＜3%。

4 結論

設置3 個不同的溫度組A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 個對照組D（未凍存配子體細胞），對不同品種的海帶配子體細胞段或細胞簇進行低溫冷凍保存，15 d 后取出，在適宜條件下發育培養了6 個月。結果表明，經不同溫度冷凍后的配子體，均可正常發育，與未經冷凍保存配子體相比較，其發育進程和發育率均無顯著差異。由此可見，經10%DMSO 處理的配子體細胞簇，可以直接放于-80 ℃或-40 ℃進行冷凍保存，但此方法的適用海帶品種范圍及保存年限還需進一步驗證。