老年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周循環(huán)中Th17/Treg免疫失衡與疾病活動的相關(guān)性

趙 雙

黃河三門峽醫(yī)院檢驗科 (河南 三門峽 472100)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是高發(fā)于老年人群的一種免疫系統(tǒng)疾病，其中發(fā)病年齡≥60歲的又被稱為老年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(elderly onset rheumatoid arthritis，EORA)，在全部類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中占比高達33%[1]。EORA在臨床上通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬甚至畸形，其發(fā)病機制至今仍未闡明，但近年來許多文獻顯示，機體自身免疫耐受的失調(diào)特別是CD4+T細胞亞群間的比例失衡在EORA的發(fā)生與進展過程中扮演了重要角色[2]。CD4+T細胞是指表面存在CD4抗原的輔助T細胞，它能夠被外源性抗原肽所激活，并在各種細胞因子的作用下活化形成具有不同功能的輔助性T細胞(T helper cell，Th)[3]。Th17是CD4+T細胞分化后的亞型之一，主要通過釋放多種類型的細胞因子參與炎癥反應(yīng)、固有免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程，在機體中發(fā)揮介導(dǎo)免疫排斥、促炎作用[4]。與TH17的功能相反，CD4+細胞的另一個亞型調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory cell，Treg)則主要介導(dǎo)免疫耐受和抗炎過程，這兩者在正常狀況下處于動態(tài)平衡，而一旦平衡被打破就會誘導(dǎo)各種自身免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤等的出現(xiàn)[5]。本次研究針對外周循環(huán)中Th17/Treg比例與EORA疾病活動性之間的相關(guān)性進行了探究，以期為EORA的早期診斷和治療靶點的選擇提供幫助。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料本研究采用回顧性分析方法，收集2019年5月至2022年5月我院風(fēng)濕免疫科收治的70例EORA患者的臨床資料，并將之納入EORA組，患者年齡62～76歲，平均年齡(69.3±6.2)歲；男性22例，女性48例；疾病活動評分：輕度22例，中度28例，重度20例。另選取同期于我院接受體檢且身體健康者40例納入健康對照組，年齡60～77歲，平均年齡(68.5±5.9)歲，男性14例，女性26例。所有研究對象均對本研究的目的、內(nèi)容知情，并簽署同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會商議并批準(zhǔn)可行。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥60歲；符合美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同提出的《類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)(2010)》中關(guān)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；接受骨關(guān)節(jié)疾病活動評分[7]：＜3.2分為輕度，3.2～5.1分為中度，＞5.1分為重度；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜60歲；合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、凝血功能障礙或罹患惡性腫瘤等疾病；合并其他自身免疫系統(tǒng)疾病；入院前2個月內(nèi)有免疫調(diào)節(jié)治療史；處在孕產(chǎn)期、哺乳期；存在精神疾病或拒絕依從。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 所有研究對象均于清晨采集隔夜空腹外周血，并置于EDTA抗凝EP管中，3000rpm離心15min后，提取上清液置于新EP管，并在-80℃冰箱中貯存。

1.2.2 檢測方法 采用流式細胞術(shù)檢測外周血中的Th17和Treg比例。Th17檢測方法：取500μl血液樣本加入離心管，每管加入等體積(1:1)1640培養(yǎng)基(10% FBS)，而后加入PMA工作液(50ng/mL)5μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置20min，而后加入BFA工作液(10μg/mL)10μl，相同條件在培養(yǎng)箱中放置5h。培養(yǎng)結(jié)束后，用移液槍將管中液體轉(zhuǎn)移至兩支流式細胞專用管，其中A管設(shè)為空白對照管，B管設(shè)為陽性樣本管，兩管均1500rpm離心10min，而后棄去上清。在B管中加入CD4 FITC 5μl后避光室溫孵育20min，而后用1mL PBS緩沖液吹打混勻重懸細胞，1500rpm離心5min，PBS緩沖液重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。A管僅用PBS緩沖液清洗、離心2次，棄去上清。在兩管中各加入1×紅細胞裂解液5mL，吹打混勻后避光室溫下裂解30min，1500rpm離心5min，PBS緩沖液2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。在管中加入500μl固定液，4℃避光固定20min，2500rpm離心5min并棄去上清，加入500μl破膜液4℃避光破膜40min，2500rpm離心5min，棄去上清，PBS緩沖液2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清，而后用少量PBS緩沖液重懸細胞。在B管中避光加入5μl PE-IL-17A 5μl，4℃避光孵育30min，PBS緩沖液2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。再次加入500μl PBS緩沖液并吹打混勻，立刻上機檢測。

Treg檢測方法：分別取100μl血樣樣本加入兩支流式細胞專用管，其中A管為空白對照管，B管設(shè)為陽性樣本管。B管中依次加入2.5μl CD4 FIFC和2.5μl CD25 APC，避光室溫孵育30min，1500rpm離心10min，棄取上清，加入PBS溶液進行2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。在兩管中各加入1×紅細胞裂解液5mL，吹打混勻后避光室溫下裂解30min，1500rpm離心5min，PBS緩沖液2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。在兩管中分別加入500μl Foxp3破核工作液，4℃避光靜置30min，2500rpm離心5min并棄去上清，加入500μl破膜液4℃避光破膜10min，2500rpm離心5min并棄去上清，使用500μl破膜液清洗、離心后，棄去上清，并用少量破膜液重懸細胞。在B管中避光加入2.5μl PE-Foxp3，4℃避光孵育30min，PBS緩沖液2次重復(fù)清洗、離心后，棄去上清。再次加入500μl PBS緩沖液并吹打混勻，立刻上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究所獲數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的定量資料用(±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩指標(biāo)間相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析。設(shè)置檢驗水準(zhǔn)α=0.05，若P＜0.05則表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述所有檢測實驗均重復(fù)至少三次。

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較各組的年齡、性別等臨床資料相比，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，可行組間比較(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組血清Th17、Treg占比比較各組間的血清Th17占比、Treg占比和Th17/Treg相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與健康對照組相比，EORA各組血清Th17占比、Th17/Treg均更高，血清Treg占比更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；在EORA患者中隨著疾病活動評分升高，血清Th17占比、Th17/Treg均升高，血清Treg占比則降低，且組間兩兩比較的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組血清Th17、Treg占比比較

2.3 EORA患者血清Th17、Treg與疾病活動評分的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Th17占比和血清Th17/Treg與疾病活動評分成正相關(guān)(r=0.731、0.853，P＜0.05)，血清Treg占比則與疾病活動評分成負相關(guān)(r=-0.484，P＜0.05)。詳見表3。

表3RA患者血清Th17、Treg與疾病活動評分的相關(guān)性

表3RA患者血清Th17、Treg與疾病活動評分的相關(guān)性

項目 r P血清Th17占比與疾病活動評分 0.731 0.001血清Treg占比與疾病活動評分 -0.484 0.001血清Th17/Treg與疾病活動評分 0.853 0.001

3 討 論

EORA是老年人常見的一種自身免疫性疾病，約60%的患者在罹患該病后兩年內(nèi)會出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞，嚴(yán)重者甚至?xí)耆珕适趧幽芰Γo患者家庭和社會均造成了巨大的經(jīng)濟和醫(yī)療負擔(dān)[8]。因此，明確EORA潛在病因及發(fā)病機制對于該病的診斷及預(yù)后預(yù)測均有重要意義。目前的研究顯示，以CD4+T細胞亞群失衡為主要表現(xiàn)的機體免疫系統(tǒng)紊亂在EORA的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9]。初始的CD4+T細胞也被稱為Th0，外源性抗原在進入機體后首先會被巨噬細胞吞噬，而后Th0會增加釋放IFN-γ并促進巨噬細胞內(nèi)MHC Ⅱ類分子表達，巨噬細胞則利用MHC Ⅱ類分子與抗原吞噬后形成的抗原肽片段結(jié)合成復(fù)合物，并將抗原肽復(fù)合物呈遞給Th0，從而激活Th0并使其分化形成Th17、Treg、Th22、Th9等亞型[10]。這些不同類型的細胞亞群在功能上存在密切聯(lián)系，有些相互促進，有些則相互抑制，它們通過分泌不同的細胞因子共同參與了機體的免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[11]。

Th17和Treg是典型的在功能上相互制約的兩種Th細胞亞型，二者的分化數(shù)量受到機體內(nèi)炎癥因子的嚴(yán)密調(diào)控，其中TGF-β的單獨作用會誘導(dǎo)Th0向Treg分化，而TGF-β和IL-6的聯(lián)合作用則會誘導(dǎo)Th0向Th17分化，當(dāng)自身免疫功能發(fā)生改變時，Th17和Treg的比例就會出現(xiàn)失衡[12-13]。EORA是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為表現(xiàn)的自身免疫性疾病，在其發(fā)生及發(fā)展過程中由于存在免疫系統(tǒng)損傷和炎癥，Th17/Treg極易出現(xiàn)失平衡。在本研究中，與健康對照組相比，EORA各組血清Th17占比、Th17/Treg均更高，血清Treg占比更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，在EORA發(fā)生后外循環(huán)中的Th17/Treg顯著升高，其中Th17的含量增加，Treg的含量則降低。Th17在機體中主要通過分泌IL-17、THF-α等炎癥因子促進炎癥反應(yīng)，在EORA發(fā)生過程中由于Th17的分化及增殖增加，大量IL-17會在IL-23的作用下經(jīng)Th17釋放入血，并在骨關(guān)節(jié)處抑制軟骨細胞形成、促進破骨細胞形成，從而造成骨關(guān)節(jié)破壞[14]。Treg則能夠通過釋放IL-10、TGF-β等細胞因子抑制炎癥反應(yīng)，最近的研究還顯示，Treg可以直接抑制Th17的IL-17分泌活性，從而發(fā)揮抗炎和免疫耐受的作用[15]。而在不同疾病活動評分的EORA患者中，疾病活動更嚴(yán)重的患者，其血清Th17占比、Th17/Treg更高，血清Treg占比則更低，且組間兩兩比較的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；進一步的相關(guān)性分析也顯示，血清Th17占比和血清Th17/Treg與疾病活動評分成正相關(guān)(r=0.731、0.853)，血清Treg占比則與疾病活動評分成負相關(guān)(r=-0.484)，這表明更高的Th17/Treg往往提示更嚴(yán)重的EORA。在EORA的進展過程中，Th17數(shù)量過多會導(dǎo)致外循環(huán)和局部骨關(guān)節(jié)中IL-17含量激增，從而誘導(dǎo)局部關(guān)節(jié)細胞內(nèi)RANKL表達量增加，過量表達的RANKL將進一步活化破骨細胞加重骨侵蝕[16]。Treg則能夠抑制RANKL通路，同時通過釋放IL-10增加骨保護素的表達并抑制粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，達到阻止骨關(guān)節(jié)破壞的作用[17]。有研究還顯示，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型小鼠中使用CXCR3拮抗劑后，小鼠膝關(guān)節(jié)中的IL-17A、IL-22等Th17分泌的因子顯著下調(diào)，而Treg的正向轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和IL-10的表達水平則明顯升高，并且外周循環(huán)Th17/Treg的失衡狀態(tài)被有效糾正，提示Th17/Treg可以作為EORA的潛在治療靶點[18]。

綜上所述，EORA患者外周循環(huán)Th17/Treg會出現(xiàn)異常升高，Th17/Tre失衡會導(dǎo)致疾病活動增強。需要注意的是，機體免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控涉及到大量的細胞因子，并且始終處在動態(tài)變化過程中，因此有關(guān)Th17/Treg免疫失衡促進EORA進展的機制及其作為治療靶點的臨床價值仍有待更大樣本量、多中心的研究予以明確。