8 周有氧和日糧限制對肥胖大鼠減重及比目魚肌MSTN 的影響

謝玉亭，王兆馨，劉秀娟

（1.南京體育學院研究生部，江蘇 南京 210000；2.南京體育學院運動健康學院，江蘇 南京 210000）

肥胖已成為全球性的健康危害， 減肥措施也因此引起了廣泛關注，運動和飲食干預是改善肥胖的常見措施［1］。 骨骼肌作為機體最大的代謝器官， 對于維持機體代謝水平和機體活動具有重要作用，肥胖往往與肌肉功能障礙有關，所以有效的減肥方式在于減輕體重的同時有效保持或增加肌肉的質量。肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是一種在骨骼肌廣泛表達，負調控骨骼肌生長的因子， 肥胖往往會造成MSTN 的增加［2］，運動［3-5］和營養限制［6-7］又均可影響MSTN 的表達，但仍存在不同爭議。 卵泡抑素 （Follistatin, FST） 是一種內源性表達的MSTN 抑制劑,其可通過與MSTN 結合，促進骨骼肌肥大［8］。 因此，本研究擬通過在同一實驗設計中,對肥胖大鼠進行有氧運動和飲食限制干預,對比有氧運動和飲食限制對肥胖大鼠比目魚肌MSTN 和FST 的影響, 為人們選擇合適的方式以改善肥胖狀態提供參考。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象和分組

6 周齡SPF 級SD 雄性大鼠36 只， 購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，適應性飼養1 周，自由進食進水，室溫（24±4）℃，濕度為50%±10%,光照比為12h∶12h。隨機選取6 只為正常組，喂養普通飼料，其余30 只為肥胖組，喂養高脂飼料，飼料購買于Research Diet(型號：D12451)，8 周后篩選出空腹體重大于正常組均值的20%的24 只肥胖大鼠，隨機分為安靜肥胖組、有氧運動組和日糧限制組，每組8 只，繼續喂養高脂飼料， 每日測定老鼠平均進食量， 每周末測量所有大鼠體重、體長（鼻尖至肛門的長度）。

1.2 有氧運動和日糧限制方案

有氧運動方案參考李常富等人的實驗［9］，以60%～70%VO2max強度進行大鼠跑臺運動，3 天適應性訓練后進行8 周的運動干預，頻率為5 天/周，時間為1 h/天，速度由8 m/s 逐漸增加至15 m/s。 日糧限制參考Mccurdy 等人的方案，以60%的對照組攝入量進行喂養［10］。

1.3 樣本采集

8 周干預結束后，禁食12 h，用20%濃度氨基甲酸乙酯進行腹腔注射麻醉（l/100 g 體重/1 m）處死，取腹主動脈血，低溫離心后吸取上清，分裝，放置-80℃冰箱保存。取大鼠腓腸肌、比目魚肌、趾長伸肌、脛骨前肌，稱重，放置-80℃冰箱保存待測。

1.4 指標檢測

1.5 肌肉組織HE 染色

將部分大鼠比目魚肌放入提前裝好的4%多聚甲醛的固定瓶中，固定24 s 以上，將肌肉組織取出脫水，然后用石蠟包埋，將蠟塊修整后進行切片，將石蠟切片進行脫蠟，用蘇木素和伊紅先后進行染色，再將組織脫水，封片后用顯微鏡鏡檢，采集肌肉組織細胞的形態圖像，分析樣本肌肉細胞的組織形態學。

1.6 蛋白檢測

研磨管中放入適量研磨珠， 加入500 μlRIPA 裂解液，取比目魚肌50 mg 放入管中, 將研磨管置于研磨機中， 以速度6.6 m/s，時間15s 的程序設置研磨2 次，靜置5 min 后10 000 r/min,4℃離心10 min， 冰上吸取上清，BCA 法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度一致后，加入蛋白上樣緩沖液，將蛋白于95℃金屬浴上變性5 min。配制SDS-PAGE 膠，以適量蛋白量上樣，進行電泳、轉印、封閉、1 抗孵育、2 抗孵育，用低溫化學發光成像系統成像拍照，最后用Image Lab 對圖像進行灰度分析。

1.7 統計方法

實驗數據用SPSS22.0 軟件處理， 各數據用平均數±標準差表示,各組間比較采用One-way ANOVA 中的兩兩比較（LSD檢驗），以p＜0.05 和p＜0.01 定為差異顯著性的界值。

2 結果與分析

2.1 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠食欲和熱量攝入的影響

與安靜肥胖組肥胖久坐的大鼠相比， 運動組和日糧限制組肥胖大鼠的進食量均顯著減少（p＜0.01），且熱量攝入也顯著減少（p＜0.01）。 具體如表1 所示。

表1 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠有關指標的影響

2.2 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠體重、 體長、Lee's 指數和肌肉質量的影響

如表1 所示，8 周干預后， 與安靜肥胖組肥胖久坐大鼠相比， 進行了有氧運動和日糧限制的肥胖大鼠體重均出現了顯著的下降（p＜0.01）；進行有氧運動的大鼠體長增加但無統計學意義（p＞0.05），而日糧限制組大鼠體長出現顯著降低（p＜0.01）； 進行有氧運動肥胖大鼠的Lee's 指數無顯著變化 （p＞0.05），日糧限制組肥胖大鼠的Lee's 指數出現降低（p＜0.05），且比運動組降低更為顯著； 進行有氧運動的大鼠肌肉質量降低、肌肉質量指數升高但均無統計學差異（p＞0.05），而日糧限制組大鼠的肌肉質量出現顯著降低（p＜0.01）、肌肉質量指數顯著升高（p＜0.01）。

2.3 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠血脂4 項和游離脂肪酸的影響

如表1 所示，8 周干預后， 與安靜肥胖組肥胖久坐大鼠相比，進行了有氧運動和日糧限制的肥胖大鼠的TG 和TCHO 均沒有發生具有統計學意義的變化（p＞0.05）；有氧運動組的肥胖大鼠的LDL 無顯著變化(p＞0.05)，而日糧限制組肥胖大鼠的LDL 出現了顯著降低 （p＜0.01）； 有氧運動組的肥胖大鼠的HDL 出現了顯著增加 （p＜0.05）， 而日糧限制組肥胖大鼠的HDL 無顯著變化（p＞0.05）；進行了有氧運動和日糧限制組大鼠的NEFA 均沒有發生具有統計學意義的變化。

2.4 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠血液MSTN、FST 的影響

如圖1 所示，8 周干預后， 與安靜肥胖組肥胖久坐大鼠相比，進行了有氧運動的大鼠血液MSTN 含量顯著下降、FST 顯著增加（p＜0.05），日糧限制的肥胖大鼠的血液、MSTN 含量無統計學意義的變化（p=0.097），FST 水平顯著降低（p＜0.05）。

圖1 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠血液MSTN、FST 的影響

2.5 有氧運動和飲食限制對肥胖大鼠比目魚肌纖維面積、質量、質量指數的影響

如圖2 所示，與安靜肥胖組相比，有氧運動組和日糧限制組大鼠比目魚肌細胞面積和質量指數均顯著增加 （p＜0.05），而8 周的有氧運動和日糧限制對大鼠比目魚肌質量無顯著影響（p＞0.05）。

圖2 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠比目魚肌纖維面積的影響

2.6 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠比目魚肌MSTN 的影響

如圖3 所示，與安靜肥胖組相比，有氧運動組大鼠比目魚肌MSTN 蛋白表達水平顯著降低、FST 蛋白表達顯著增加（p＜0.05），日糧限制組大鼠比目魚肌MSTN、FST 蛋白表達水平無顯著變化（p＞0.05）。

圖3 有氧運動和日糧限制對肥胖大鼠比目魚肌MSTN、FST蛋白表達的影響

3 討論

8 周的實驗干預后，有氧運動運動組大鼠和飲食限制組大鼠的進食量以及熱量攝入較安靜肥胖組均出現顯著減少，且日糧限制組減少更為顯著。 目前，關于研究肥胖的動物實驗很多，但針對動物肥胖的界定還暫無黃金標準，除卻體重外，大鼠的Lee's 指數也被認為可以敏感地反應大鼠的肥胖，所以本實驗選取大鼠體重和Lee's 指數雙重指標來反應肥胖大鼠在有氧運動和日糧限制干預后的減肥效果。 從體重上，8 周的有氧運動和日糧限制都可以有效地降低肥胖大鼠的體重， 且與中等強度的有氧運動相比，40%的日糧限制可以更有效地降低大鼠的Lee's 指數，這可能與日糧限制組的進食量和攝入的熱量減少更為顯著有關。 本研究發現，8 周的有氧運動后大鼠腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌肉和趾長伸肌總質量和質量指數均無顯著變化， 提示了有氧運動所造成的體重減輕主要是由于脂肪重量的減少所造成的； 而日糧限制組大鼠四塊肌肉質量之和出現顯著降低， 一定程度上提示了大鼠肌肉質量的減少， 而其肌肉質量指數的顯著增加則與日糧限制所帶來的顯著體重降低有關。 研究顯示運動可以有效改善血脂異常，提高HDL 水平，促進膽固醇逆向轉運［11］，這與研究結果一致，8 周有氧運動后肥胖大鼠的血液HDL 水平顯著提高。 8 周的有氧運動和日糧限制對于血液TC、TG 和NEFA 均無顯著影響，但日糧限制可以有效降低血液LDL 水平， 這可能與日糧限制后的饑餓狀態導致大鼠脂肪利用和代謝增加有關。

MSTN 在動物出生后可通過自分泌或旁分泌信號，限制肌肉纖維的數量和大小，抑制肌肉蛋白的合成，對骨骼肌的生長發育進行負調控。 研究顯示，耐力訓練可以顯著降低糖尿病大鼠血液和骨骼肌MSTN 水平［12］，這與本研究一致，8 周的有氧運動后血液MSTN 水平和比目魚肌MSTN 的蛋白表達水平均顯著降低。 目前針對飲食限制對MTSN 的影響仍存在爭議，研究顯示， 母體的營養限制會導致后代MSTN mRNA 表達的增加，而對MSTN 的蛋白表達無影響［13］，禁食早期飲食限制會造成MSTN mRNA 的表達增加， 而隨著禁食時間的延長， 出現mRNA 水平的降低［14］，食物的剝奪會導致MSTN 的表達增加［6］或降低［7］，這可能與飲食限制的介入時間、限制程度、持續時間以及個體的年齡有關。MSTN 主要通過蛋白的表達來產生生物作用， 本研究顯示，8 周的日糧限制并沒有造成血液MSTN 水平和比目魚肌MSTN 蛋白表達的顯著改變， 這可能與快肌纖維更容易受到飲食限制的影響產生萎縮有關， 且比目魚肌主要以慢肌為主，而MSTN 主要在快肌中表達。

MSTN 在體內可受FST 的調控，FST 是機體的一種自分泌激活素結合糖蛋白， 可以通過與MSTN 結合從而抑制其作用［15］，正向調節肌肉的生長。 研究顯示，急性離心運動可以通過刺激FST 向血液中釋放，抑制循環MSTN 水平［16］，這與本研究的結果一致，8 周的有氧運動運動可以顯著提高血液FST水平并降低MSTN 的水平。 運動可以提高大鼠腓腸肌FSTL1蛋白表達的增加［17］，這與本研究的結果一致，8 周的有氧運動顯著提高了比目魚肌FST 蛋白表達。研究顯示，熱量限制可以導致血液FST 的降低［18］，這與本研究結果一致，8 周的日糧限制后血液FST 水平顯著降低。 目前針對飲食限制對骨骼肌FST 蛋白表達的影響研究較少， 本研究發現8 周的日糧限制對于比目魚肌的FST 蛋白表達并無顯著影響。

8 周有氧運動可以顯著降低肥胖大鼠體重，但對肌肉的質量指數無顯著影響， 顯著降低血清MSTN 的水平， 提高血清FST 的水平，顯著增加大鼠比目魚肌的橫截面積和質量指數，8 周有氧運動可以顯著降低比目魚肌MSTN 表達，增加比目魚肌FST 的蛋白表達， 提示在肥胖的狀態下有氧運動對比目魚肌的影響可以通過MSTN 和FST 發揮作用， 這與之前的研究相符。 研究顯示，運動可以降低MSTN 的表達［19］，提高FST 的表達［20］，FST 的過表達可以抑制MSTN 的表達，促進骨骼肌肥大和肌肉質量的增加［21］。8 周日糧限制可以顯著降低肥胖大鼠體重、Lee's 指數和肌肉質量， 對血清MSTN 水平無顯著影響但可以顯著降低血清FST 水平， 顯著增加大鼠比目魚肌橫截面積和質量指數， 研究顯示熱量限制可以有效減緩衰老過程中的肌肉萎縮［22］，但也有研究表明熱量限制會導致骨骼肌纖維面積的減?。?3］，這可能與機體的年齡有關。 8 周的日糧限制對比目魚肌MSTN 和FST 的蛋白表達均無顯著變化， 提示在肥胖狀態下有氧運動和日糧限制對比目魚肌的影響與MSTN和FST 的關系不大。

4 結論

8 周的有氧運動和日糧限制均能顯著降低肥胖大鼠體重，且日糧限制更為顯著；8 周的有氧運動對肌肉質量影響不大，日糧限制會造成肌肉質量的下降。

8 周的有氧運動可以通過增加FST 表達， 降低MSTN 表達，促進比目魚肌橫截面積增加。

8 周的日糧限制對調節肥胖大鼠比目魚肌的變化與MSTN 的關系不大。