動物性食品中氨基糖苷類藥物電化學(xué)傳感檢測方法研究進(jìn)展

張 冉，李兆周*，石婧怡，劉艷艷，杜賀團(tuán)

（1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471000；2.河南省食品綠色加工與質(zhì)量安全控制國際聯(lián)合實驗室，河南洛陽 471000）

氨基糖苷類抗生素（Aminoglycoside antibiotics，AGs）通過與原核生物的核糖體結(jié)合而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而實現(xiàn)抑制或殺滅細(xì)菌的作用，常作為飼料添加劑和治療藥物被用于畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及養(yǎng)蜂業(yè)[1]。近年來，藥物濫用導(dǎo)致的食品安全問題日益突顯。肉類、牛奶、雞蛋和蜂蜜等動物性食品中存在的AGs 殘留以及相關(guān)的耐藥基因?qū)οM(fèi)者的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[2]。長期食用含有抗菌藥殘留的食物會引起過敏反應(yīng)、人體腸道內(nèi)菌群失衡、產(chǎn)生腎毒性和耳毒性等毒副作用。世界上多個國家和國際組織制定了動物性食品中AGs 的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

食品安全檢測是避免藥物殘留危害的必要手段，針對該類藥物殘留檢測的方法主要包括儀器方法、微生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等。儀器分析方法靈敏度和準(zhǔn)確性高，但常需要對靶標(biāo)進(jìn)行衍生化處理，樣品處理復(fù)雜、成本高、費(fèi)時費(fèi)力，對操作人員的要求較高。免疫分析法作為一種常用的篩查分析手段，在現(xiàn)場快速檢測中得到了廣泛應(yīng)用，預(yù)處理簡單、時間短、成本低，但其準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步提升[3]。微生物學(xué)方法雖然較為經(jīng)典，性價比高，但檢測的靈敏度、特異性和時效性較差?；谏鲜鰴z測與識別原理而發(fā)展起來的電化學(xué)傳感器，具有低成本、快速、靈敏和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，分析過程簡單且易于操作，設(shè)備易于微型化且方便攜帶，能夠現(xiàn)場實時檢測。

電化學(xué)傳感器基于識別元件和靶標(biāo)物質(zhì)之間的特異性結(jié)合作用，將檢測信息轉(zhuǎn)化為有用的電化學(xué)信號進(jìn)行分析。近年來，電化學(xué)傳感器因其優(yōu)異的靈敏度、快速的分析效率和易于小型化等優(yōu)點(diǎn)，在藥物殘留檢測方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景[4]。其中，抗體作為這類傳感器的重要元件，常用來特異性識別待測物。但生物性抗體對環(huán)境條件要求很高且制備成本高，而分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers，MIPs）和核酸適配體（Aptamer，Apt）作為仿生抗體具有高親和力、特異性、穩(wěn)定性和可靠性，其作為抗體替代物已受到了廣泛關(guān)注。

1 基于抗體的電化學(xué)傳感器

抗體能特異性地與抗原結(jié)合，在電化學(xué)傳感器中常作為識別元件用于食品安全檢測。與單克隆或多克隆抗體相比，通過基因工程技術(shù)制備的重組抗體具有成本更低、耗時更短和親和力更高的特性。LIU等[5]開發(fā)了一種簡單、靈敏的電化學(xué)免疫分析方法用于檢測食品中鏈霉素（Streptomycin，STR）殘留。在該方法中，以納米金粒子修飾的介孔二氧化硅作為增敏材料，H2O2作為顯色底物，固相包被的STR抗體作為識別元件，通過直接競爭，實現(xiàn)蜂蜜、牛奶、雞肉和腎臟樣品中STR 的痕量檢測，該方法的檢測限為5 pg·mL-1，線性范圍為0.05 ～50.00 ng·mL-1?？贵w優(yōu)異的特異性識別性能有助于實現(xiàn)高效傳感分析，但生物源性抗體對環(huán)境條件耐受性差，易受溫度、pH 值及環(huán)境條件等因素的影響而導(dǎo)致其生物活性降低，研發(fā)高特異性和高穩(wěn)定性的仿生識別元件已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

2 基于適配體的電化學(xué)傳感器

Apt 是通過指數(shù)富集配體進(jìn)化迭代過程而得到的特異化核酸短序列。與抗體等其他識別元件相比，Apt 具有成本低、容易合成、穩(wěn)定性好和易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)傳感器的構(gòu)建中應(yīng)用廣泛。基于Apt的電化學(xué)傳感器以特異性核酸序列為特異性識別元件，通過信號感應(yīng)元件將識別作用轉(zhuǎn)變?yōu)楣夂碗姷瓤梢暤男盘?，實現(xiàn)對靶標(biāo)的高效檢測。

近年來，基于STR 殘留檢測的適配體傳感器已取得顯著進(jìn)展。YIN 等[6]構(gòu)建了一種基于金納米顆粒功能化的磁性多壁碳納米管（Au@MWCNTs-Fe3O4）和納米多孔PtTi（Nanoporous PtTi，NP-PtTi）合金的電化學(xué)適配體傳感器，用于檢測STR。通過Au@MWCNTs-Fe3O4復(fù)合材料對電極表面進(jìn)行修飾，在其表面沉積NP-PtTi，并將STR 適配體固定在NP-PtTi/Au@MWCNTs-Fe3O4/GCE 上。所制備的Au@MWCNTs-Fe3O4/NP-PtTi 復(fù)合物不僅具有顯著的增敏效果，還可以有效提高STR 適配體的載量，增強(qiáng)識別性能。在最優(yōu)條件下，該傳感器的檢測限為7.8 pg·mL-1，線性范圍為0.05 ～100.00 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為97.3%～105.2%。該方法雖能高效檢測STR，但傳感界面的構(gòu)建較為復(fù)雜，影響因素較多。為更好地檢測食品中痕量STR 殘留，ROUSHANI等[7]將介孔氧化硅薄膜（Mesoporous Silica Films，MSFs）滴涂在金電極表面，并在MSFs 表面修飾銀納米粒子，構(gòu)建了超靈敏的STR 電化學(xué)適配體傳感器。當(dāng)傳感器的識別元件與STR 特異性結(jié)合后，可以抑制[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)移，降低響應(yīng)電流信號。在最佳條件下，該傳感器的檢測范圍是1 fg·mL-1～6.2 ng·mL-1，檢出限為0.33 fg·mL-1。為進(jìn)一步提高傳感界面的比表面積、生物相容性、電化學(xué)特性和理化穩(wěn)定性，PENG 等[8]提出了一種基于Ti3C2和金屬有機(jī)框架納米材料的新型電化學(xué)適配體傳感器，用于快速檢測牛奶樣品中的STR。新型納米復(fù)合材料的應(yīng)用有效提高了傳感器的檢測性能，在最佳條件下，該傳感器的線性范圍為0.01 ～200.00 nmol·L-1，檢測限為0.003 3 nmol·L-1。

基于適配體的電化學(xué)傳感器在其他AGs 殘留分析中也進(jìn)行了相關(guān)研究，NONG 等[9]開發(fā)了一種基于適配體的新型妥布霉素電化學(xué)傳感器，利用亞甲基藍(lán)（Mthylene Blue，MB）產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)信號，構(gòu)建了基于金納米粒子/聚苯胺/二氧化鈦納米管復(fù)合材料修飾的工作電極，顯著提高了電極表面的電子傳遞速率。在0.5 ～70.0 μmol·L-1，MB 電流信號與妥布霉素濃度呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.326 μmol·L-1。該方法雖然實現(xiàn)了樣品中妥布霉素的電化學(xué)實時分析，但相關(guān)分析方法學(xué)參數(shù)還有待提高。

在適配體傳感器中引入納米復(fù)合材料用于信號放大，顯著改善了電化學(xué)性能，提高了檢測靈敏度和穩(wěn)健性，縮短了檢測時間，拓寬了應(yīng)用前景。但目前適配體的篩選過程仍相對復(fù)雜，增敏納米材料的大規(guī)模制備及應(yīng)用還有一定困難。未來應(yīng)進(jìn)一步提高識別和增敏元件性能，推動適配體傳感分析理論與實際應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。

3 基于仿生印跡的電化學(xué)傳感器

仿生印跡是基于仿生學(xué)原理，在聚合物基質(zhì)中人工構(gòu)建識別位點(diǎn)的新技術(shù)。采用該技術(shù)研制的MIPs 具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、識別特異性、高度穩(wěn)定性、廣泛適用性和制備便捷性等優(yōu)點(diǎn)。目前已成功應(yīng)用于分離、純化、催化和電化學(xué)傳感等領(lǐng)域。仿生印跡電化學(xué)傳感器是一種結(jié)合了特異性印跡識別和電化學(xué)快速檢測的傳感器，MIPs 作為識別元件具有高特異性、高靈敏度和長期穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在構(gòu)建生物傳感器方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

基于不同仿生印跡識別元件和增敏材料的電化學(xué)傳感器均有所報道，QUE 等[10]提出了以苯胺和鄰苯二胺為雙功能單體，在金電極表面共聚制備MIPs，通過直接競爭模式進(jìn)行特異性識別，采用葡萄糖氧化酶作為標(biāo)記物，實現(xiàn)電化學(xué)信號的放大與增敏。所研制的傳感器可用于牛奶和蜂蜜中STR 的檢測，線性檢測范圍為0.01 ～10.00 mg·mL-1，檢出限為7.0 pg·mL-1。該方法雖能實現(xiàn)對靶標(biāo)的高效分析，但標(biāo)記酶對環(huán)境條件耐受性差，檢測方法的穩(wěn)健性能仍有待提升。LONG 等[11]研究了一種基于磁性多壁碳納米管的新型磁印跡電化學(xué)傳感器，可用于復(fù)雜基質(zhì)中卡那霉素（Kanamycin，KAN）的高效分析。多壁碳納米管修飾的Fe3O4納米顆粒具有較大的比表面積和良好的導(dǎo)電性。在其基礎(chǔ)上制備磁性MIPs，大幅提高了傳感器特異性和靈敏度，所得檢出限為2.3×10-11mol·L-1。該方法將磁性檢測技術(shù)與納米材料相結(jié)合，實現(xiàn)了高性能印跡與識別。為進(jìn)一步提高檢測靈敏度，降低電化學(xué)分析的背景干擾，有研究創(chuàng)新了傳感信號種類，基于光電信號構(gòu)建傳感器，取得了較好進(jìn)展。LU 等[12]基于ZnO/ZnS/Ag2S 陽極和摻雜鐵的CuBi2O4陰極光電材料，構(gòu)建了一種自供電的分子印跡光電化學(xué)傳感器，用于STR 的快速靈敏檢測。該傳感器提高了抗干擾能力和靈敏度，具有更寬的檢測范圍（0.01 nmol·L-1～10 mmol·L-1）、更低的檢測限（0.005 3 nmol·L-1）和更好穩(wěn)定性，大幅降低了樣品的基質(zhì)干擾，提高了分析方法的性能。

仿生印跡的電化學(xué)傳感器雖然具有突出優(yōu)點(diǎn)，但識別的特異性和親和力還有待進(jìn)一步提高，相關(guān)的識別機(jī)理還需要深入分析和研究，未來應(yīng)繼續(xù)深入研究基于仿生印跡技術(shù)的新型識別元件和增敏材料，進(jìn)一步提高印跡識別性能，推動該領(lǐng)域迭代升級。

4 雙識別電化學(xué)傳感器

單一識別模式的電化學(xué)傳感器雖能進(jìn)行痕量殘留物靶向分析，但特異性和抗干擾能力仍需提高。研制具有雙重識別作用的電化學(xué)傳感器，特別是將仿生印跡材料與核酸適配體相結(jié)合，已成為該領(lǐng)域發(fā)展的新趨勢。在識別元件的構(gòu)建過程中，將Apt作為功能單體引入MIPs 的制備，構(gòu)建具有雙重識別能力的識別元件MIP-Apt，可以大幅提高與目標(biāo)分析物結(jié)合的特異性和親和力。此外，MIP-Apt 中的聚合物基質(zhì)可以阻止核酸酶降解適配體鏈，提高了Apt 穩(wěn)定性。仿生印跡與適配體識別技術(shù)的結(jié)合，開辟了一個構(gòu)建高性能識別元件的有效途徑，在藥物與食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、生物分析等領(lǐng)域有廣闊的發(fā)展空間。BI 等[13]提出了一種用于檢測KAN 的高特異性和高靈敏度電化學(xué)傳感檢測方法。采用殼聚糖-石墨烯復(fù)合膜和金納米粒子修飾玻碳電極，在修飾電極表面進(jìn)行印跡膜的電聚合。然后將二茂鐵-β-環(huán)糊精和KAN 適配體修飾在Au@Fe3O4復(fù)合材料上作為電化學(xué)感應(yīng)信號分子。KAN-Apt 作為識別元件，特異性識別復(fù)雜基質(zhì)中的痕量KAN 殘留。新型生物識別元件的構(gòu)建顯著提高了傳感器的親和力和特異性，在最優(yōu)條件下，該傳感器的線性范圍為10 ～500 nmol·L-1，檢測限為1.87 nmol·L-1。

雙識別電化學(xué)傳感檢測方法有效提升了仿生印跡識別的特異性和生物識別的穩(wěn)定性，拓展了分子識別理論內(nèi)涵和應(yīng)用場景。但該方法需同時研制兩種識別體系，工作量較大，且兩種識別體系間的協(xié)同增效作用仍需深入研究和優(yōu)化。

5 展望

開發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)和靈敏的AGs 殘留檢測技術(shù)對動物源性食品安全和人體健康具有重要意義。電化學(xué)傳感器因其具有靈敏度高、響應(yīng)快、操作簡單、低成本以及便于攜帶等優(yōu)勢，在食品安全領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。新型生物識別元件和增敏材料的研發(fā)已成為電化學(xué)傳感檢測技術(shù)發(fā)展的新趨勢，未來電化學(xué)傳感器將朝著便攜化、高通量、高靈敏和多殘留快速檢測的方向進(jìn)一步發(fā)展。