人尿源干細胞外泌體對髓核樣尿源干細胞增殖及分化的影響

朱有福 李承威 沈娜娜 相宏飛 陳伯華 郭柱

(青島大學附屬醫院脊柱外科,山東 青島 266035)

椎間盤退變(IDD)是下腰痛的最常見原因［1］,藥物及手術兩種方式雖能緩解患者疼痛,卻無法恢復椎間盤功能［2］。因此,椎間盤組織工程因其具有改善IDD、恢復髓核功能的特點,逐漸成為IDD治療領域的研究熱點［3］。組織工程技術通過將材料學與干細胞及其衍生物結合發揮治療作用［4］,其中常用干細胞為間充質干細胞(MSC)［5］。然而MSC獲取困難,無法廣泛應用［6］。人尿源干細胞(USC)來源廣泛,無倫理爭議,具有與MSC接近的生物學特性,獲取方式簡單無創［7-8］。研究證明,USC可被髓核細胞(NPC)誘導分化為髓核樣尿源干細胞(NP-USC)［9-10］。組織工程中干細胞需要同時發揮效應細胞作用以及一定程度的增殖能力［11］,因此探究干細胞分化程度與增殖速率的關系顯得尤為重要［12］。本研究通過對不同時間下經NPC誘導USC所獲得NP-USC的增殖速率、髓核樣細胞標記基因和軟骨細胞特異性基因與其對應蛋白的表達差異性進行研究,旨在探討不同分化程度NP-USC的增殖速率及USC-EXO對其促增殖的作用,為椎間盤組織工程篩選合適的NP-USC提供依據。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

胎牛血清、無外泌體血清購自美國Gibco公司,USC成骨誘導、成脂誘導以及成軟骨誘導分化培養基試劑盒均購自美國Cyagen公司,兔抗HIF-1α、抗GLUT1、抗COL2、抗ACAN以及抗β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗人IgG二抗購自美國Santa公司。

1.2 NPC的提取和培養

NPC培養基共50 mL,包含5 mL體積分數0.1胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,剩余以DMEM/F12培養基補足。收集2022年4—6月我院脊柱外科10例L4～L5椎間盤突出患者手術切除的髓核組織樣本,無菌轉運至超凈臺內,洗凈分離髓核組織并充分剪碎至直徑1 mm左右的組織塊。用磷酸緩沖鹽溶液PBS洗滌3次,轉入15 mL離心管中,加入10 mL髓核細胞培養基及2 mLⅡ型膠原酶,轉至恒溫搖床中37 ℃下充分消化髓核組織。過濾后20 ℃下將濾液1 200 r/min離心5 min,棄去上清液保留細胞沉淀。以NPC培養基懸浮細胞,20 ℃下1 000 r/min離心5 min,棄上清液留細胞沉淀,添加NPC培養基調整細胞密度至5×108/L,接種到12孔板中,轉至37 ℃、含體積分數0.05 CO2的溫箱中培養,3 d后篩選出可見少許NPC細胞團簇的孔板,更換原培養基繼續培養。此后每3 d換液,待細胞融合度達90%左右傳代,后續實驗取用第3代NPC。

1.3 USC的提取和培養

USC原代培養基共50 mL,包含5 mL體積分數0.1胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,600 μL生長因子添加劑REGM SingleQuot,剩余體積則以DMEM/F12培養基補足。收集同期5名健康成年男性志愿者的潔凈中段尿,在超凈臺內移入50 mL離心管中,室溫下1 500 r/min離心5 min,棄上清液至每管剩余0.2 mL。使用USC原代培養基重懸剩余液體,向0.1%明膠溶液包被過的24孔板內每孔加入0.5 mL重懸液,轉至37 ℃、含體積分數0.05 CO2的溫箱中培養,5 d后篩選出可見少許USC細胞團簇的孔板,更換培養基繼續培養。此后每3 d換液,待細胞融合達90%左右傳代,后續實驗取用第3代USC。

1.4 USC的鑒定

將第3代USC接種到6孔板中,按成骨、成脂、成軟骨誘導分化試劑盒說明書配制誘導培養基,待USC融合度達80%左右,將細胞分為1、2、3組。1組進行成骨誘導,每孔加入2 mL USC成骨誘導分化完全培養基,每3 d換液,于第21天時加入4%多聚甲醛固定,茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察染色情況。2組進行成脂誘導,每孔先加入USC成脂誘導分化培養基A液,于3 d后再換為USC成脂誘導分化培養基B液,1 d后重新換成A液,交替更換培養基14 d后,用4%多聚甲醛固定,油紅O染色后倒置顯微鏡觀察染色情況。3組進行成軟骨誘導,每孔加入0.5 mL USC成軟骨誘導分化完全培養基,每3 d更換一次培養基,在21 d后用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,以阿利辛藍染色后倒置顯微鏡下觀察染色情況。

取第3代USC,37 ℃下胰酶消化3 min,獲得細胞懸液,加入DMEM/F12培養基終止消化。用移液管將USC的細胞懸液吸至15 mL離心管中。20 ℃下400 r/min離心5 min。離心后棄上清液,剩余約0.2 mL細胞沉淀轉至超凈臺,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS對USC洗滌3次。用移液槍取10 μL細胞懸液滴至計數板進行細胞計數,用移液槍分別取200 μL USC細胞懸液分裝至5支1.5 mL微型離心管中,每管均加入10 μL的CD29、CD44和CD73一抗,冰盒內靜置,避光保存1 h。以4 ℃預冷離心機5 min,將上述微型離心(EP)管以1 500 r/min離心5 min,再次用含1% BSA的PBS溶液洗滌EP管內USC 3次,以提純細胞。PBS重懸USC,上述微型離心管每管內加入2.5 μL HRP標記的兔抗人IgG二抗,于冰盒內避光靜置保存20 min。以4 ℃預冷離心機10 min,然后將上述的EP管以1 500 r/min離心5 min,離心后使用含1% BSA的PBS洗滌EP管內USC 1次。將USC重懸后置于流式細胞儀中檢測USC陽性標記物CD29、CD44和CD73的表達。

1.5 USC-EXO的提取與鑒定

配置無外泌體USC培養基50 mL,包含5 mL體積分數0.1的無外泌體胎牛血清,500 μL 1%青-鏈霉素,以及600 μL生長因子添加劑REGM SingleQuot,剩余體積以DMEM/F12培養基補足。取第3代USC,加入無外泌體的USC培養基,轉移至37 ℃、含體積分數0.05 CO2的溫箱中培養,72 h后,吸取培養皿中培養基轉至50 mL離心管過濾,再轉入超速離心管,加熱封口,將上述超速離心管置于4 ℃下預冷超高速離心機以500 g離心10 min,吸取上清液以去除細胞。將上清液以2 000 g離心10 min,離心后吸取上清液以去除細胞碎片,之后將上清液以10 000 g離心10 min,離心以后吸取上清液以去除凋亡小體,再取上清液以12 000 g離心120 min。棄上清液,PBS重懸獲得USC-EXO懸液,使用100 μL EP管分裝,-80 ℃冰箱保存備用。

以37 ℃水浴加熱解凍USC-EXO懸液,吸取10 μL滴加至載樣銅網,靜置5 min自然晾干,移液槍吸取10 μL濃度為3%的磷鎢酸溶液,滴加至載樣銅網后自然晾干,透射電鏡觀察USC-EXO并拍照記錄。移液槍另吸取10 μL USC-EXO懸液加入比色皿中,使用PBS補足懸液至比色皿體積2/3處,光面朝外置于粒徑分析儀中檢測粒徑分布情況。

1.6 NPC與USC共培養

取第3代NPC接種于24孔板底部,每孔加入200 μL NPC培養基,并放置于Transwell小室,向小室中接種第3代USC,加入150 μL USC完全培養基。將上述共培養細胞分為A、B、C組,A組細胞先共培養7 d,再將共培養獲得的NP-USC在無外泌體USC培養基中培養14 d;B組細胞先共培養14 d,再將共培養獲得的NP-USC在無外泌體USC培養基中培養7 d;C組細胞共培養21 d。小室內外每天更換新的培養基。另將第3代USC及NPC分別在無外泌體USC培養基中培養21 d,設為USC組及NPC組。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測髓核樣細胞標記基因及軟骨細胞特異性基因的表達

取1.6中5組細胞,分別在不加USC-EXO及添加USC-EXO的條件下培養28 d后,采用Trizol法提取細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,以此為模板進行RT-qPCR。根據試劑盒說明書配制反應體系,以GADPH作為內參照,每個樣品分別設置3個復孔,實驗重復進行3次。采用2-△△CT法計算樣本中HIF-1α、GLUT1、COL2及ACANmRNA的相對表達水平。引物名稱及其序列見表1。

表1 NPC相關基因引物序列

1.8 Western blot法檢測髓核樣細胞標記蛋白及軟骨細胞特異性蛋白的表達

取1.6中5組細胞,將培養皿中的培養基吸棄,4 ℃預冷PBS沖洗3次,加入3 mL含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟的細胞裂解液,冰上裂解30 min;使用細胞刮輕輕刮下細胞,置入離心管中,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清液置于冰上備用,BCA法測蛋白濃度。將蛋白和蛋白上樣緩沖液混均后進行變性,然后用SDS-PAGE分離樣品,再轉移到PVDF膜上。于含體積分數0.05脫脂奶粉的封閉液中封閉后,加入ACAN、GLUT1、COL2A1及HIF-1α一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜后加入HRP標記的兔抗人二抗室溫孵育1 h,再使用ECL方法顯影,顯影后使用IPP6軟件測定上述5組細胞中ACAN、GLUT1、COL2及HIF-1α蛋白的灰度值。

1.9 CCK-8法檢測USC及NPC細胞增殖情況

取1.6中5組細胞,分別置于12孔板中,加入無外泌體USC培養基培養。各組每孔均加入1.5中所提取的USC-EXO 200 μL。在培養至第7、14、21、28天時,對各組細胞各加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h,使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值,并計算細胞活力以代表增殖速率。細胞活力=(吸光度測量值-吸光度空白值)/(吸光度對照值-吸光度空白值)×100%。實驗重復3次,結果取均值。

1.10統計學分析

2 結 果

2.1 USC鑒定結果

1組細胞經茜素紅染色后鏡下細胞內滿布鈣結節(圖1A),2組細胞經油紅O染色后鏡下可見紅染的胞內脂滴(圖1B),3組細胞經阿利新藍染色后鏡下細胞內藍染糖胺聚糖分布明顯(圖1C)。流式細胞術分析結果顯示,USC中CD29(99.11%)、CD44(98.85%)和CD73(94.27%)均高表達。

A:成骨分化誘導后茜素紅染色結果,B:成軟骨分化誘導后阿利新藍染色結果,C:成脂分化誘導后油紅O染色結果

2.2 USC-EXO鑒定結果

使用透射電鏡觀察USC-EXO直徑、數量及大小,納米粒徑分析外泌體直徑分布情況。在透射電鏡下觀察載樣銅網上的USC-EXO懸液,可看到多個大小不一的圓形囊泡及部分不規則形囊泡,直徑介于50～150 nm;經粒徑分析發現,外泌體直徑分布接近于正態分布,直徑主要在120 nm左右,與透射電鏡觀察結果相同。

2.3 倒置顯微鏡觀察NPC與USC共培養結果

倒置顯微鏡下觀察結果顯示,A組NP-USC增殖至占據全部視野的40%～50%,其形態介于紡錘形和短梭形間;B組NP-USC增殖達到接觸融合,其形態均為規則梭形或多角形;C組NP-USC細胞形態與B組無明顯差異,形態呈規則梭形或多角形;NPC、USC組細胞分別呈規則梭形和紡錘形。

2.4 A、B、C、USC、NPC組細胞HIF-1α、GLUT1、ACAN、COL2 mRNA相對表達量比較

RT-qPCR結果顯示,未添加USC-EXO以及添加USC-EXO時,5組細胞間的HIF-1α、GLUT1、ACAN及COL2 mRNA相對表達量均有顯著差異(F=982.09～1 488.54,P<0.01);其中USC、A、B、C組的HIF-1α、GLUT1、COL2、ACANmRNA相對表達量呈逐漸升高趨勢(t=53.36～371.86,P<0.01),但C組與NPC組4種基因相對表達量無顯著差異(P>0.05),加入USC-EXO前后比較各組細胞中4種基因的相對表達量亦無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組ACAN、COL2、GLUT1、HIF-1α mRNA相對表達量比較

2.5 A、B、C、USC、NPC組細胞HIF-1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白相對表達量比較

Western blot方法檢測結果顯示,5組細胞的HIF1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白相對表達量比較有顯著性差異(F=95.72～190.44,P<0.01),其中USC、A、B、C組4種蛋白的相對表達量分別依次升高(t=65.21～185.51,P<0.01),但C組與NPC組4種蛋白相對表達量無顯著差異。見圖2、表3。

圖2 Western blot方法檢測5組細胞HIF1α、GLUT1、ACAN、COL2蛋白表達

表3 各組細胞ACAN、COL2、GLUT1、HIF-1α蛋白相對表達量比較

2.6 A、B、C、USC及NPC組細胞增殖能力比較

重復測量設計的方差分析結果顯示,時間、組別對細胞活力均有顯著的影響(F時間=767.74,F組別=327.55,P<0.05),時間與組別交互作用對細胞活力無顯著性影響(P>0.05)。單獨效應結果顯示,在各時間點USC、A、B、C組細胞活力依次下降(F=3.77～103.58,P<0.05),但C組與NPC組無顯著性差異(P>0.05)。5組中每組細胞在第7、14、21、28天時,細胞活力均依次升高(F=9.96～121.68,P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞在第7、14、21及28天時細胞活力比較

3 討 論

隨著全球老齡化人口的增加,IDD正逐漸演變成一個難以忽視的健康問題［13］。IDD是一種涉及衰老、壓力、過負荷［14］、遺傳［15］等因素的自然進程,能引發椎間盤突出、椎管狹窄,使患者活動受限,影響其生活質量。IDD的治療選擇包括保守治療和手術治療［16］,但這些方法均不能改善IDD。在美國等發達國家中,與IDD治療有關的直接和間接成本估計每年超過100億至200億美元［17］。組織工程作為椎間盤再生治療的熱門研究方向之一［18］,可能從源頭解決NPC老化凋亡問題。組織工程實驗中需要的干細胞應同時具有干細胞的增殖潛力及效應細胞的作用,換言之,誘導分化程度過高或過低的干細胞均不適合用于組織工程實驗。本課題組先前研究發現,NPC可通過共培養的方式誘導人USC分化為NP-USC,但尚不了解不同誘導程度下NP-USC分化程度及增殖能力［10］。

誘導干細胞定向分化為髓核樣細胞是現今椎間盤組織工程的研究重點方向［19］。確認分化為髓核樣細胞的關鍵在于檢測NPC標記基因HIF-1α與GLUT1以及軟骨細胞特異性基因COL2以及ACAN的表達情況［20-23］。HIF-1α基因在纖維環和軟骨終板中均不表達,僅在氧分壓正常條件下的NPC中特異性表達,可以用于檢測髓核樣細胞中。GLUT1基因同樣僅僅表達于髓核細胞中。COL2、ACAN基因主要由軟骨細胞表達,其中COL2蛋白是椎間盤中最主要成分［24］,ACAN是椎間盤的主要非膠原成分。HIF-1α與GLUT1為NPC細胞標記基因,僅在NPC細胞中大量表達［25］,USC中不表達或少量表達。ACAN與COL2基因在軟骨細胞中具有不同程度的表達,可區分干細胞是否向軟骨樣細胞分化,但無法區分其是否為髓核樣細胞。本研究通過對HIF-1α、GLUT1、COL2、ACAN基因及其蛋白的檢測可區分NP-USC分化程度。

本研究顯示,HIF-1α、GLUT1、COL2、ACAN在C組高表達,且表達量與NPC組相近,在USC、A、B組間表達量呈遞增的趨勢;添加USC-EXO與未添加USC-EXO以后,NP-USC均表達HIF-1α、GLUT1等NPC標記基因及COL2、ACAN等軟骨特異性基因,且其表達量無明顯差異性。根據上述結果可推斷,NPC誘導USC時間越長,所形成的NP-USC分化程度越高,且是否添加USC-EXO不影響NP-USC的分化程度,即USC-EXO可能不具有促進NP-USC進一步分化的能力。RT-qPCR和Western blot法檢測結果表明,USC在與NPC共培養的過程中逐漸向髓核樣細胞分化,USC與NPC共培養第14天時獲得的NP-USC既具有介于USC與NPC之間的增殖潛力,又能夠大量表達COL2、ACAN,更適合應用于椎間盤組織工程。而CCK-8法檢測結果提示,USC-EXO可促進USC、A組及B組細胞的增殖,但對NPC組與C組細胞增殖無促進作用。

本研究結果顯示,NPC誘導USC的時間越長,所形成的NP-USC分化程度越高,增殖速率越低。USC-EXO具有促NP-USC增殖的能力,但其不具有促分化的能力;NP-USC分化程度越高,USC-EXO的促增殖能力越低。本研究仍存在一定的局限性,例如雖已發現隨著NP-USC分化時間的延長,USC逐漸向髓核樣細胞分化,但對于植入椎間盤后如何控制NP-USC的分化趨勢及增殖速率,仍需后續實驗進一步研究確定。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL25665)。所有試驗過程均遵照《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：朱有福、李承威、沈娜娜參與了研究設計;朱有福、相宏飛、陳伯華、郭柱參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。