Ang-1模擬肽協(xié)同血管內(nèi)皮生長因子對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能的影響

王軍珂 宋思奇 施春英 于忠祥

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 3 青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)院)心臟中心)

缺血性心臟病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。在心肌缺血期間,局部的血液供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡和病理性重塑,進(jìn)一步發(fā)展為心力衰竭［1］。促血管生成治療是指通過形成新生血管恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)［2-4］。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子之一,能夠誘導(dǎo)體內(nèi)新生血管的生長。然而在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),中低劑量的VEGF重組蛋白給藥后由于其快速擴(kuò)散不能在心肌梗死區(qū)域形成足夠的有效濃度［5-8］。而高劑量的VEGF重組蛋白雖然有效卻可能會(huì)引起患者嚴(yán)重的不良反應(yīng)［9-10］。VEGF主要作用于新生血管網(wǎng)形成早期,而血管生成素-1(Ang-1)在后期能夠募集血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,因此Ang-1能有效促進(jìn)血管的成熟［11］。Ang-1模擬肽(AMP)為一段來源于Ang-1的特異性短肽QHREDGS,可模擬Ang-1的活性,在體內(nèi)及體外均具有與Ang-1相似的促血管形成的能力,可以抑制心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡［12-14］。因此,AMP可模擬Ang-1的功能,在血管生成的過程中發(fā)揮與VEGF協(xié)同的作用。為了提高VEGF在缺血區(qū)的有效濃度,本研究使用可以與細(xì)胞外基質(zhì)-膠原特異性結(jié)合的CBD-VEGF重組蛋白,以心臟細(xì)胞外基質(zhì)(c-ECM)水凝膠作為生物支架,將CBD-VEGF以及AMP結(jié)合在c-ECM上,以構(gòu)建CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠,將該水凝膠注射到大鼠心肌梗死模型梗死區(qū)域后,觀察其對(duì)大鼠心臟功能的影響,以期能夠?yàn)槿毖孕呐K病的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和豬心臟由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;8～10周齡SD雄性大鼠共12只,體質(zhì)量200～260 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。AMP、Bio-AMP(修飾了Biotin的AMP)購于生工生物工程(上海)股份有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma公司;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、血管性血友病因子(vWF)抗體、胞質(zhì)緊密粘連蛋白1(ZO1)抗體購于英國Abcam公司。

1.2 c-ECM的制備

將豬心臟切成小塊,交替使用高滲/低滲NaCl、胰蛋白酶、Triton-X-100以及SDS溶液進(jìn)行處理,去除心肌細(xì)胞,對(duì)脫細(xì)胞組織進(jìn)行冷凍干燥后,獲得c-ECM,掃描電子顯微鏡下觀察顯示其結(jié)構(gòu)空隙較大,可以被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將c-ECM研磨成細(xì)粉后置于胃蛋白酶和HCl混合溶液中,攪拌48 h,與NaOH和PBS在4 ℃下混合,然后于37 ℃下反應(yīng)30 min,得到c-ECM水凝膠。

1.3 MTT試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的AMP和Ang-1對(duì)HUVEC活性的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞,以5 000個(gè)/孔的密度接種于48孔板中,加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 h以后,分別加入連續(xù)濃度梯度(0、25、50、100 nmol/L)的Ang-1和連續(xù)濃度梯度(0、25、50、100 nmol/L)的AMP,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取出48孔板,去除培養(yǎng)液,每孔加入20 μL的MTT,37 ℃下培養(yǎng)4 h,吸出MTT,再加入150 μL二甲基亞砜,采用酶標(biāo)儀測(cè)量波長490 nm處吸光度值,以吸光度值表示HUVEC活性。

1.4 Bio-AMP和c-ECM結(jié)合實(shí)驗(yàn)

向96孔板中每孔加入c-ECM 水凝膠100 μL,用pH為8.0含4 mmol/L EDTA的PBS洗滌3次后,每孔再加入配好的Traut(2.5 g/L)試劑100 μL,室溫反應(yīng)2 h,生成Traut-c-ECM凝膠復(fù)合物。在另一個(gè)96孔板中分別加入0、25、50、100 μmol/L濃度梯度的Bio-AMP,每孔100 μL,加入過量的Sulfo-SMCC室溫反應(yīng)1 h,生成Bio-AMP-Sulfo-SMCC復(fù)合物。將上面生成的不同濃度Bio-AMP-Sulfo-SMCC復(fù)合物與Traut-c-ECM凝膠復(fù)合物混合后,室溫孵育1 h,作為實(shí)驗(yàn)組;同時(shí)將0、25、50、100 μmol/L濃度梯度的BSA加入過量的Sulfo-SMCC中室溫孵育1 h,并與Traut-c-ECM凝膠復(fù)合物混合,室溫孵育1 h,為對(duì)照組。將5%的BSA溶液分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中,室溫封閉1 h,再分別加入S-AP,每孔100 μL,37 ℃下100 r/min反應(yīng)2 h。隨后加入P-NPP室溫反應(yīng)15 min,反應(yīng)完畢后加100 μL的NaOH溶液0.2 mol/L終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長405 nm處的吸光度值,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組與c-ECM的結(jié)合力以吸光度值表示。每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,結(jié)果取均值。

1.5 大鼠的分組及處理

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,常規(guī)手術(shù)找到冠狀動(dòng)脈左前降支,用6-0絲線結(jié)扎左前降支,構(gòu)建心肌梗死模型。將模型構(gòu)建成功的大鼠隨機(jī)分為PBS組(A組)、c-ECM/CBD-VEGF組(B組)和CBD-VEGF/c-ECM/AMP組(C組),每組4只。A組:將100 μL的PBS溶液經(jīng)心外膜注射到大鼠梗死部位;B組:將10 μg CBD-VEGF直接連接在c-ECM水凝膠上,后經(jīng)心外膜注射到大鼠梗死部位;C組:先將10 μg CBD-VEGF直接連接在c-ECM水凝膠上,再通過化學(xué)交聯(lián)劑與10 μg AMP交聯(lián),然后經(jīng)心外膜注射到大鼠梗死部位。最后3組大鼠均清除胸腔內(nèi)積血并放置留置針,防止氣胸,將胸壁逐層縫合消毒。用留置針抽吸胸腔內(nèi)的氣體和液體,之后取出留置針。術(shù)后連續(xù)3 d每只大鼠肌肉注射青霉素(160萬單位)和卡洛芬(2 mg/kg)。

1.6 超聲檢測(cè)各組大鼠的心臟功能

各組大鼠均于治療后3個(gè)月時(shí)全身麻醉,經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖進(jìn)行檢測(cè)。采用EchoPacTM軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。以左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)為評(píng)價(jià)大鼠心臟功能的指標(biāo)。

1.7 免疫熒光染色

將全麻的各組大鼠脫頸處死后,從心尖處注射生理鹽水沖洗心臟后,取出心臟分離出心肌梗死的區(qū)域,切成碎塊,固定于40 g/L多聚甲醛中24 h,蔗糖脫水后OCT包埋,制備5 μm厚冰凍切片。分別用α-SMA抗體(1∶400稀釋)、vWF抗體(1∶800稀釋)、ZO1抗體(1∶200稀釋)對(duì)切片進(jìn)行染色后,置于熒光顯微鏡下觀察、拍照,采用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分別計(jì)算血管數(shù)量(α-SMA抗體標(biāo)記的數(shù)量)、vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的AMP和Ang-1對(duì)HUVEC活性的影響

在AMP和Ang-1濃度均為0 nmol/L時(shí)HUVEC的吸光度值分別為0.32±0.04、0.40±0.02,均為25 nmol/L的濃度時(shí)HUVEC的吸光度值分別為0.48±0.06、0.55±0.04,均為50 nmol/L的濃度時(shí)HUVEC的吸光度值分別為0.49±0.02和0.53±0.06,均為100 nmol/L濃度時(shí)HUVEC的吸光度值分別為0.47±0.02、0.45±0.01,各處理濃度的吸光度值比較無顯著差異(P>0.05)。

2.2 Bio-AMP與c-ECM的結(jié)合力檢測(cè)

結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組中不同濃度的BSA與c-ECM的結(jié)合力比較均無顯著性差異(P>0.05);在實(shí)驗(yàn)組中,隨著Bio-AMP濃度升高,BSA與c-ECM結(jié)合力逐漸升高(F=19.050,P<0.05);組間比較顯示,在BSA和Bio-AMP濃度均為0.5、1.0 g/L時(shí),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的BSA與c-ECM的結(jié)合力比較差異具有顯著意義(t=5.041、5.148,P<0.05),在BSA和Bio-AMP濃度均為0、0.25 g/L時(shí)兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 BSA、Bio-AMP與c-ECM的結(jié)合力比較

2.3 各組大鼠心臟功能比較

各組大鼠均處理3個(gè)月以后,心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示,A～C組的EF值分別為(67.93±3.17)%、(75.70±4.37)%和(85.47±3.20)%,3組間比較差異有顯著性(F=23.610,P<0.05),組間兩兩比較差異均有顯著性(t=2.855～7.794,P<0.05)。

2.4 各組大鼠心肌梗死區(qū)域相關(guān)指標(biāo)的比較

各組大鼠處理3個(gè)月后,免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示,3組大鼠心肌梗死區(qū)域的血管數(shù)量、vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比進(jìn)行比較差異均有顯著性(F=13.360～223.300,P<0.05),組間兩兩比較,心肌梗死區(qū)域vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比差異均有顯著性(t=4.328～22.390,P<0.05),血管數(shù)量方面進(jìn)行比較,B組、C組與A組之間具有顯著差異(t=3.500、4.950,P<0.05),B組與C組無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠心肌梗死區(qū)域相關(guān)指標(biāo)比較

3 討 論

全球人群中心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率逐年增高,其中心肌梗死和心力衰竭是死亡的主要原因之一［15］。雖然心肌梗死患者初次經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療提高了早期生存率,但其5年生存率僅為50%［3］。近年來,各種促血管生成的生長因子被廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療［2,16］。然而,其療效并不是很理想,可能因?yàn)檫@些研究只是以單個(gè)生長因子為研究對(duì)象,而忽略了其他生長因子的相互影響,例如Ang-1、血小板衍生生長因子等生長因子聯(lián)合使用對(duì)穩(wěn)定新生血管具有協(xié)同作用［17-18］。因此,多種因子聯(lián)合使用的效果可能要優(yōu)于單一生長因子的使用。

本研究生成的c-ECM水凝膠經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察顯示,其結(jié)構(gòu)空隙較大,可以為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增生以及新生血管網(wǎng)的形成提供足夠的空間支持,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究是以c-ECM水凝膠作為基質(zhì),并結(jié)合CBD-VEGF和AMP,檢測(cè)CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能的影響。目前治療缺血性心臟病中常使用的生物材料有纖維蛋白［19］、透明質(zhì)酸［20］、基質(zhì)膠［21］、海藻酸鹽［22］、殼聚糖［23］、自組裝肽［24］、微球［25］等,這些生物材料本身也具有促進(jìn)血管再生和心臟功能恢復(fù)的能力［26］。c-ECM是通過脫細(xì)胞處理去除原有的心肌細(xì)胞組分,留下心臟組織細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵的信號(hào)分子,這對(duì)于心臟組織工程發(fā)揮著重要的作用［27］。另外,c-ECM具有可生物降解性、生物相容性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)［28］。在包括大鼠和豬的心肌梗死模型在內(nèi)的多種體內(nèi)模型中,注射c-ECM水凝膠后能夠促進(jìn)新生血管形成,保護(hù)心肌細(xì)胞,并且恢復(fù)心臟功能［29-31］。因此,本研究使用c-ECM作為生物支架攜帶VEGF和AMP。

本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的AMP、Ang-1對(duì)HUVEC活性的影響,其結(jié)果表明合成的AMP和Ang-1具有相似促進(jìn)HUVEC增殖的能力,因此將AMP用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),可以保證實(shí)驗(yàn)效果。為了檢測(cè)設(shè)計(jì)的Bio-AMP和c-ECM的結(jié)合能力,本研究使用Traut試劑與c-ECM交聯(lián),Sulfo-SMCC和Bio-AMP化學(xué)交聯(lián),進(jìn)而將Bio-AMP結(jié)合在c-ECM上,結(jié)果顯示Bio-AMP與c-ECM的結(jié)合力較強(qiáng),可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以往研究表明,重組VEGF蛋白或VEGF基因治療心肌缺血以后,可以增強(qiáng)缺血心肌側(cè)支循環(huán)的血流量,并且改善心臟功能［6,32-33］。但是這種療法的安全性還有待進(jìn)一步提高,因?yàn)楦邉┝康腣EGF有導(dǎo)致血管瘤形成的風(fēng)險(xiǎn),并且VEGF的擴(kuò)散也可能會(huì)引起其他嚴(yán)重不良反應(yīng)。ZHANG等［34］成功制備了一種由VEGF和CBD組成的融合蛋白CBD-VEGF,并且實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白CBD-VEGF能穩(wěn)定地與Ⅰ型膠原結(jié)合并維持VEGF的活性。而且CBD-VEGF能夠聚集在梗死區(qū)域,保持CBD-VEGF的局部有效濃度,改善大鼠心肌梗死之后的心臟功能。另外,REIS等［35］首次證明了QHREDGS多肽(即AMP)修飾的水凝膠可以顯著改善心肌梗死后心臟功能。因此本研究把CBD-VEGF加載到c-ECM水凝膠上,并且通過化學(xué)交聯(lián)將AMP連接在c-ECM水凝膠上,將其注射在大鼠心肌梗死的部位。為了評(píng)估大鼠心肌梗死區(qū)域血管生成的情況,本研究通過vWF、α-SMA檢測(cè)了心肌梗死區(qū)域血管新生狀況,檢測(cè)的結(jié)果顯示,與CBD-VEGF/c-ECM進(jìn)行比較,CBD-VEGF/c-ECM/AMP能夠顯著促進(jìn)更多的血管生成,并且心臟功能明顯改善,提示VEGF和AMP在促進(jìn)大鼠心肌梗死治療中具有協(xié)同作用。緊密連接或閉合帶可在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間形成一個(gè)連續(xù)的屏障,能夠阻斷頂端和基底外側(cè)細(xì)胞表面之間跨膜蛋白的運(yùn)動(dòng)［36］。ZO1是一種接頭蛋白,可將閉合蛋白和密封蛋白等跨膜連接蛋白結(jié)合到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上面［37］。因此ZO1對(duì)緊密連接的形成發(fā)揮不可或缺的作用。為了檢測(cè)大鼠心肌梗死區(qū)域細(xì)胞之間的連接情況,本研究通過ZO1抗體對(duì)ZO1也進(jìn)行了檢測(cè),其結(jié)果顯示,心肌梗死模型大鼠經(jīng)CBD-VEGF/c-ECM/AMP治療以后,ZO1陽性面積比顯著高于經(jīng)CBD-VEGF/c-ECM治療大鼠,提示相較于CBD-VEGF/c-ECM,CBD-VEGF/c-ECM/AMP能夠形成更多的細(xì)胞連接。

綜上所述,本研究合成了CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠,該水凝膠通過心外膜注射到心肌梗死區(qū)域后可以顯著促進(jìn)心肌梗死區(qū)域血管再生,增強(qiáng)細(xì)胞之間的連接,并可促進(jìn)心肌梗死后心臟功能的恢復(fù),可能為臨床上缺血性心臟病患者的治療提供新的可能。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QDU-AEC-2023-365)。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照動(dòng)物使用和護(hù)理指南的條例進(jìn)行。

作者聲明：王軍珂、宋思奇、施春英、于忠祥參與了研究設(shè)計(jì);王軍珂、施春英、于忠祥參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。