基于μ阿片受體羧基端375STANT379磷酸化位點的多肽干預對嗎啡介導的受體下游信號通路的影響

李笑妍 周筱慧 董河 董銘心

(1 青島大學附屬醫院麻醉科,山東 青島 266075; 2 青島大學藥學院)

嗎啡作為經典的阿片類鎮痛藥物在臨床中應用廣泛,具有強效鎮痛作用［1］。然而嗎啡在發揮強大鎮痛作用的同時,也會產生藥物耐受、呼吸抑制、便秘、成癮等副作用,極大地限制了其臨床使用［2-4］。因此,如何在使用嗎啡鎮痛時盡可能減少其副作用發生,成為目前學界研究的重點問題。既往研究發現嗎啡主要通過激活μ阿片受體(MOR)發揮鎮痛作用,但是此過程也導致了嗎啡的副作用［5］。MOR羧基端包含了11個絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的關鍵磷酸化位點,當阿片類藥物激活受體時,這些位點可被G蛋白偶聯受體激酶(GRKs)和蛋白激酶C磷酸化［6］,而羧基端多位點磷酸化是促進MOR脫敏和內吞的關鍵因素［7］。本課題組前期基于MOR羧基端的375STANT379磷酸化位點設計并合成了多肽TAT-Q368-T379［8］,本研究以該多肽作為研究工具,探討MOR羧基端的375STANT379關鍵磷酸化位點對受體下游G蛋白信號通路以及β-arrstin2信號通路的影響,為開發能夠與嗎啡聯用以增強鎮痛作用的藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞與質粒 HEK-293細胞購自北京中科質檢生物技術有限公司,MOR質粒來源于上海聯慧腦智工程研究中心,pGloSensorTM-22F cAMP質粒購買于美國Promega公司,MOR-C端標記Nanoluc質粒、β-arrestin2-N端標記EYFP質粒由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2試劑與儀器 醫用鹽酸嗎啡購買于東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,DAMGO購買于美國AbMole公司,Forskolin購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Cmpd101購買于北京偶合科技有限公司,HA-Tag抗體購買于美國Cell Signaling technology公司,Alexa Fluor 555標記的驢抗小鼠抗體購買于上海碧云天生物技術有限公司,正置雙光子全光譜快速掃描共聚焦顯微鏡購買于日本Nikon公司。

1.2 HEK-293細胞培養

將HEK-293細胞置于含體積分數0.10的胎牛血清和100 kU/L青霉素和鏈霉素(1∶1)混合液的DMEM培養基中,置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱培養,隔天傳代一次,待HEK-293細胞傳到第8代且細胞融合度約90%時用于后續實驗。

1.3 GloSensor cAMP生物傳感器測定cAMP的含量

將HA-MOR質粒與pGloSensorTM-22F質粒共轉染至HEK-293細胞中,轉染24 h后,在96孔板每孔接種100 μL的細胞懸液,培養24 h后丟棄培養基,換成平衡培養基(不含酚紅的DMEM培養基和2%的GloSensor cAMP試劑原液)于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中孵育30 min,孵育完成后,將細胞分為6組并進行如下處理:①A組:每孔加入100 μL不含酚紅DMEM培養基;②B組:每孔加入90 μL不含酚紅的DMEM培養基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚紅DMEM培養基;③C組:每孔加入90 μL不含酚紅DMEM培養基后分為7個亞組,各亞組加入含濃度10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L嗎啡(后文以濃度梯度10-11～10-5mol/L嗎啡代指)的10 μL不含酚紅DMEM培養基;④D組:每孔加入80 μL不含酚紅的DMEM培養基,然后加入溶解有0.5×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養基后,下設7個亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養基;⑤E組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養基后,下設7個亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養基;⑥F組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養基,然后加入溶解有2×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養基后,下設7個亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL無酚紅DMEM培養基。除A組外,B～F組每組分別加入含濃度10-5mol/L Forskolin的1 μL不含酚紅DMEM培養基,孵育15 min,最后用多功能酶標儀測定A～F組細胞全波長化學發光強度(LI)。通過計算藥物作用以后的cAMP抑制率以反映藥物對于MOR下游G蛋白依賴性信號通路的激活的程度,cAMP抑制率=［(LIForskolin組-LI空白組)-(LI藥物處理組-LI空白組)］/(LIForskolin組-LI空白組)×100%。每組分別設置3個復孔,實驗需重復3次,結果取均值。多肽TAT-Q368-T379由本課題組前期構建［8］。

1.4 蛋白質相互作用分析法測定嗎啡激動MOR后對β-arrestin2的募集效應

將MOR-C端標記Nanoluc的質粒和β-arrestin2-N端標記EYFP的質粒共轉染至HEK-293細胞中。轉染24 h后,在96孔板每孔中接種100 μL的細胞懸液,于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中孵育過夜。24 h后丟棄培養基,將細胞分為5組并進行如下處理:①G組:每孔加入90 μL不含酚紅的DMEM培養基;②H組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚紅DMEM培養基;③I組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養基以后,下設8個亞組,各個亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養基;④J組:每孔加入70 μL不含酚紅的DMEM培養基,再加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養基后,下設8個亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養基;⑤K組:每孔加入70 μL不含酚紅的DMEM培養基,再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的10 μL不含酚紅DMEM培養基后,下設8個亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養基。G～K組每孔加入溶解有Nluc底物(1∶1 000)的10 μL不含酚紅DMEM培養基孵育3 min,然后使用多功能酶標儀測定G～K組在波長460 nm處的LI以及540 nm處的熒光強度(FI)。計算每孔的凈BRET值以反映藥物對MOR下游β-arrestin2信號通路的激活的程度,凈BRET值=FI藥物處理組/LI藥物處理組-FI空白組/LI空白組。每組設3個復孔,實驗重復3次,結果取均值。

1.5 細胞免疫熒光染色法測定嗎啡激動MOR后受體內吞水平的變化

將瞬時轉染表達HA-MOR的HEK-293細胞接種在放置于24孔板中的多聚賴氨酸包被的玻片上生長過夜。24 h后丟棄培養基,將識別MOR氨基端HA標簽的一抗(1∶100)稀釋于DMEM培養基中并在37 ℃下培養細胞1 h,隨后將細胞分為4組并進行如下處理:①L組:每孔加入2 mL DMEM培養基;②M組:每孔加入1.9 mL DMEM培養基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養基;③N組:每孔加入1.8 mL DMEM培養基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的100 μL DMEM培養基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養基;④O組:每孔之中加入1.8 mL的DMEM培養基,然后再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的100 μL DMEM培養基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養基。完成藥物處理后用40 g/L多聚甲醛固定L～O組細胞,將Alexa Fluor 555標記的驢抗小鼠二抗(1∶500)稀釋于DMEM培養基中,然后孵育L～O組細胞1 h。通過熒光在共聚焦顯微鏡下對L～O組MOR進行細胞定位,檢測細胞的平均熒光強度,以細胞表面受體熒光強度表示嗎啡激動MOR后受體內吞水平的變化。每組選用45～50個細胞,每組實驗重復3次。

1.6 統計學分析

使用GraphPad Prism軟件處理數據,得到量效關系曲線并擬合出各分組中嗎啡的效價參數半數最大有效濃度(EC50)和效能參數最大效應(Emax)。使用SPSS軟件進行統計學分析,各組間EC50值、Emax值及半定量分析指標差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 多肽TAT-Q368-T379對嗎啡激活MOR下游G蛋白依賴性cAMP信號通路的影響

通過C～F組及其7個亞組的cAMP抑制率擬合量效關系曲線得出,C～F組細胞EC50值分別為2.33±0.73、1.34±0.45、0.49±0.08、0.38±0.07,組間比較差異有顯著性(F=13.12,P<0.05);與C組比較,D、E、F組細胞的EC50值均顯著減小(P<0.05)。

2.2 多肽TAT-Q368-T379和Cmpd101對嗎啡激活MOR下游β-arrestin2信號通路的影響

通過I～K組及其8個亞組的凈BRET值擬合量效關系曲線得出,I～K組細胞的Emax值為0.23±0.00、0.17±0.01、0.12±0.00,組間比較差異具有顯著性(F=185.95,P<0.05),與I組比較,J、K組細胞的Emax值均顯著減小(P<0.01)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379對嗎啡誘導的MOR內吞的影響

共聚焦成像結果顯示,與L組相比,M組細胞可觀察到MOR發生明顯內吞,而N、O組細胞內吞的MOR明顯比M組減少(圖1)。L～O組細胞的表面受體熒光強度分別為100.00±13.11、81.28±10.56、92.58±12.86、93.72±13.30,組間比較差異有顯著性(F=17.46,P<0.05);與L組比較,M組細胞表面受體熒光強度顯著減小(P<0.01),與M組進行比較,N、O組細胞表面受體熒光強度均顯著增高(P<0.01)。

圖1 各組HEK-293細胞中MOR內吞水平的比較

3 討 論

MOR是一種Gi/o亞型的G蛋白偶聯受體。當MOR與其激動劑在細胞內結合后,活化的MOR通過Gα蛋白發出信號,抑制腺苷酸環化酶活性并減少cAMP積累,通過G蛋白的βγ亞單位激活內向整流K+通道和抑制電壓門控Ca2+通道,從而產生鎮痛作用［9-10］,細胞內活化的MOR也被GRKs磷酸化,導致β-arrestin2募集,從而啟動MOR脫敏、內吞和再循環過程［6］。研究發現,β-arrestin2敲除小鼠表現為阿片類藥物誘導的鎮痛作用增強,藥物耐受、呼吸抑制和便秘均得到改善［11-13］。后續關于β-arrestin2敲除小鼠的研究再次證實了MOR下游β-arrestin2信號通路對阿片類藥物的鎮痛作用及藥物耐受至關重要［14-15］,但是對呼吸抑制、便秘的作用具有一定爭議［7］。

MOR羧基端具有多個Ser、Thr關鍵磷酸化位點,受體下游信號通路傳導的效率能夠受到多位點的調節［16］。通過定量質譜以及細胞生物學分析發現,375STANT379基序是阿片類藥物介導MOR磷酸化的關鍵位點［17］。有研究通過Western blot實驗檢測MOR激動劑誘導的Thr370和Ser375位點磷酸化證實了上述觀點［18］。阿片類藥物活化MOR后介導的受體羧基端位點磷酸化是分層次進行的,首先是Ser375位點發生快速并且顯著的磷酸化,隨后則依次是Thr370、Thr379及Thr376位點的磷酸化［19-21］。最近有研究發現,HEK-293細胞中GRK2以及GRK3能夠明顯促進包括375STANT379位點在內的MOR多位點磷酸化以及MOR內吞［20-22］,并且Thr370、375STANT379位點對于MOR脫敏、內吞以及β-arrstin2募集均是必要的［21］。

大部分研究通過使用轉基因小鼠間接證明了MOR羧基端375STANT379位點磷酸化在受體下游細胞信號通路中的作用,但這種情況下不能排除參與MOR調節的其他信號蛋白的磷酸化。本課題組前期根據MOR羧基端的375STANT379磷酸化位點設計合成了多肽TAT-Q368-T379,實驗結果顯示,多肽TAT-Q368-T379與嗎啡聯合使用時,能夠明顯增強嗎啡的鎮痛作用,說明375STANT379磷酸化位點與嗎啡的鎮痛相關［8］。為探究多肽TAT-Q368-T379發揮作用的分子機制,本文研究了該多肽對嗎啡介導的MOR下游細胞信號通路的影響。

在本研究中,通過GloSensor cAMP生物傳感器檢測發現,多肽TAT-Q368-T379與嗎啡聯用能夠使嗎啡的cAMP抑制率明顯增高,即多肽增強了MOR下游G蛋白信號通路的激活。說明多肽在一定程度上可以防止嗎啡脫敏的發生。這一結論也與本課題組前期的體內實驗結果相一致［8］。蛋白質相互作用分析法和細胞免疫熒光染色法分析顯示,在HEK-293細胞中GRK2/3抑制劑Cmpd101能夠明顯減少嗎啡誘導的β-arrestin2募集和MOR內吞,這也與既往研究的觀點一致［16,23］。同時,本研究顯示,基于MOR羧基端375STANT379磷酸化位點設計的多肽TAT-Q368-T379可以起到與Cmpd101類似的作用,因此推測HEK-293細胞中多肽可能通過競爭性抑制375STANT379位點的磷酸化,從而阻止β-arrestin2募集和MOR內吞。此機制可通過進一步的蛋白免疫印跡實驗進行驗證。關于在動物體內β-arrestin2招募與阿片類藥物副作用的關系,包括藥物耐受、便秘和呼吸抑制等,也可進一步將多肽與嗎啡聯合應用于相關的動物模型中進行驗證。

綜上所述,基于本課題組前期所設計的多肽TAT-Q368-T379,本研究證實了該多肽干預能夠在MOR下游G蛋白信號通路和β-arrestin2信號通路中發揮重要作用,此為增強阿片類藥物鎮痛作用及改善藥物副作用提供了新思路。

作者聲明：董河、董銘心、李笑妍參與了研究設計;董銘心、李笑妍、周筱慧參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。