四君子湯治療酒精性肝損傷的效果及其機制

尤紅娟 李筱媛 韓亞斐 周泉 陳雪紅 呂秋蘭 姚如永

(1 青島大學基礎醫學院醫學藥理學系,山東 青島 266071; 2 青島大學附屬醫院中醫科; 3 青島大學附屬醫院醫學研究中心)

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)又稱酒精性肝病,包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化等［1］。近年來ALD病死率逐年升高,成為世界范圍內關注的熱點［2］。以往研究表明酒精導致的腸道菌群變化是誘發ALD的主要機制之一,在疾病發展中起到重要促進作用［3-4］,但目前ALD尚無針對性的治療措施,亟需尋找防治ALD的新方案。

四君子湯源于《太平惠民和劑局方》,主要由人參、白術以及茯苓和甘草組成,具有益氣健脾之功效［5］。研究發現四君子湯能夠調節腸道菌群、提高腸道的免疫功能［6］,但其對ALD的防治作用尚未見相關報道。傳統中醫認為“肝病當先實脾”,脾氣旺盛,肝疾可愈［7］。本研究基于“實脾治肝”思路,探討四君子湯調節腸道菌群治療ALD的療效,為四君子湯治療酒精性肝病提供實驗依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠32只,體質量19～21 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養于青島大學附屬醫院SPF級實驗動物中心,環境溫度(20±2)℃左右,相對濕度(50±10)%,12-12 h晝夜周期。

1.2 主要試劑與藥品

中藥人參、茯苓、白術以及甘草購買于青島大學附屬醫院藥劑科(批號:SYKGQDYXGS,上藥控股青島有限公司);谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、總膽紅素(T-BIL)和堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自深圳市邁瑞生物醫藥電子有限公司;體積分數0.56的乙醇溶液購自北京紅星股份有限公司。

1.3 中藥制備

將人參、茯苓、白術、甘草(配制比例9∶9∶9∶6)放入陶瓷鍋中,用700 mL蒸餾水浸泡 1 h,武火煮沸后,改用文火熬制40 min,隨后用三層紗布過濾,重復煎煮2次。然后合并水煎液,再用文火濃縮成1.0 g/mL,4 ℃下保存,使用時加熱至37 ℃。

1.4 動物分組及處理

C57BL/6小鼠隨機分為正常組(A組)、酒精模型組(B組)、四君子湯低劑量組(C組)和四君子湯高劑量組(D組),每組8只。各組小鼠自由進食飲水,適應環境1周后進行實驗。每天8:00,B～D組小鼠灌胃體積分數0.56的乙醇溶液(6 g/kg),A組小鼠灌胃等劑量的生理鹽水,同日17:00,C、D組小鼠分別灌胃5、10 g/kg的四君子湯,A、B組小鼠灌胃等劑量生理鹽水。連續灌胃18 d,觀察小鼠狀態,每5 d記錄一次小鼠體質量和攝食量。

灌胃結束后,無菌收集新鮮糞便,備用。隨后所有小鼠禁食5 h,灌胃10 μL/g異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FD-4,50 g/L,相對分子質量為4 400,Sigma-Aldrich),3.5 h以后各組小鼠使用異氟烷麻醉,眼眥取血200 μL,備用。1 d后麻醉各組小鼠并摘取眼球取血,備用;斷頸處死并快速解剖小鼠肝臟、脾臟備用。

1.5 小鼠肝臟指數和脾臟指數測定

準確稱量各組小鼠肝臟、脾臟質量,計算肝指數以及脾指數,肝指數=肝臟濕質量/體質量×100%,脾指數=脾臟濕質量/體質量×100%。

1.6 小鼠血清生化指標檢測

取各組小鼠眼球所取血液,分離血清,并使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清當中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平。

1.7 小鼠肝臟和脾臟組織病理學分析

取各組小鼠肝臟和脾臟組織,用40 g/L多聚甲醛溶液固定,常規切片,按試劑盒說明書對脾臟和部分肝臟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,另一部分肝臟切片行油紅O染色,光學顯微鏡下觀察拍照。

1.8 小鼠腸道通透性檢測

取各組小鼠眼眥所取血液200 μL,分離血清,以生理鹽水按照1∶2比例稀釋以后,在激發波長485 nm、發射波長528 nm下采用熒光分光光度計測量熒光強度。根據標準曲線,測定血液中FD-4的濃度,依據FD-4濃度變化反應腸道通透性。

1.9 腸道菌群分析

從每組中隨機選取5例糞便樣本,交由上海美吉生物進行16S rDNA中v3～v4區域高通量測序分析。對測序結果優化處理后按照97%相似性進行操作分類單元(OTU)聚類。根據OTU豐度,用Mothur計算隨機抽樣下Sobs、Shannon、Coverage指數,利用R語言工具繪制稀釋曲線,反映樣本測序數據量是否合理;使用Mothur軟件進行α多樣性分析,得到代表物種豐富度的指標Chao和代表物種多樣性的指標Shannon;使用QIIME軟件和R語言進行β多樣性中PCoA分析并繪圖。根據分類學分析結果,運用R語言工具對不同分組在門、屬水平上物種組成和相對豐度進行綜合性分析。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 四君子湯對小鼠體質量、肝指數以及脾指數的影響

灌胃結束時,A組小鼠毛色黑亮,精神抖擻,行動敏捷;B組小鼠毛色暗淡發灰,精神萎靡,食欲不振;C、D組小鼠毛色鮮亮,精神狀態、行動力正常。各組小鼠體質量比較差異有顯著性(F=8.41,P<0.05),其中B組與A、D組比較體質量顯著性降低(t=3.38、4.02,P<0.05),C組與B組體質量比較,差異無顯著性(P>0.05);各組小鼠的肝指數、脾指數比較差異均有顯著性(F=5.38、4.72,P<0.05),其中B組與A、D組比較小鼠的肝指數、脾指數顯著升高(t=2.72～4.58,P<0.05),而C組與B組比較肝指數、脾指數差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 四君子湯對小鼠體質量、肝指數以及脾指數的影響

2.2 四君子湯對小鼠肝功能和血脂的影響

各組小鼠血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG和TC水平比較差異具有顯著性(F=9.43～36.42,P<0.05),其中B組與A、C、D組比較小鼠血清中ALT、AST、TC水平顯著增加(t=2.19～7.62,P<0.05);B組與A、D組相比較,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平均顯著性升高(t=3.51～5.94,P<0.05),而C組與B組相比較,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平降低,差異無顯著統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 四君子湯對ALD小鼠肝功能和血脂指標的影響

2.3 四君子湯對小鼠肝脾形態的影響

脾臟組織HE染色結果見圖1a,A組小鼠脾細胞結構完好,紅髓白髓界限清晰,無明顯病理形態改變;B組小鼠脾細胞結構崩解,大量細胞溶解壞死(箭頭示);C組小鼠脾細胞結構趨于正常,但紅髓白髓界限處有細胞溶解(箭頭示);D組小鼠脾細胞結構、紅髓白髓趨于正常,界限清晰,與A組比較無明顯差異。

肝臟組織HE染色結果見圖1b,A組小鼠肝組織結構完整,肝索排列整齊,未見明顯異常;B組小鼠肝索結構紊亂,大量肝細胞氣球樣變,胞質空泡化(箭頭示);C、D組小鼠肝索排列趨于正常,肝細胞脂肪變性明顯減輕,其中A、D組形態接近一致。

肝臟組織油紅O染色結果見圖1c,A組小鼠肝臟無明顯異常;B組小鼠肝臟中脂滴增大,數量增多,脂肪蓄積嚴重(箭頭示);C組小鼠肝臟脂肪蓄積情況明顯減輕(箭頭示);D組小鼠肝臟無明顯脂肪蓄積,與A組小鼠的肝臟組織幾乎一致。

2.4 四君子湯對小鼠的腸道通透性的影響

A～D組小鼠的血清當中FD-4的濃度分別達到(0.21±0.04)、(0.59±0.31)、(0.44±0.19)、(0.24±0.06)mg/L;各組間比較差異具有顯著性(F=7.61,P<0.05),其中B組與A、D組比較,小鼠的腸道通透性顯著增高(t=3.50、3.19,P<0.05),C組與B組小鼠的腸道通透性進行比較,差異均無顯著意義(P>0.05)。

2.5 四君子湯對小鼠腸道菌群多樣性的影響

本研究基于Sobs指數的稀釋曲線趨于平坦(圖2a),說明本次測序數據量合理;基于Shannon指數的稀釋曲線趨于平坦(圖2b),說明本次測序數據量足夠大;基于Coverage指數的稀釋曲線顯示整體Coverage值趨近于1(圖2c),說明測序深度良好,整體覆蓋率較高,能真實反映樣品中的微生物群落狀況。綜合以上結果,本次測序數據合理,可用于后續的多樣性分析。

a:基于Sobs指數的稀釋曲線,b:基于Shannon指數的稀釋曲線,c:腸道功群基于Coverage指數的稀釋曲線

小鼠腸道菌群α多樣性分析顯示,各組小鼠腸道菌群Chao指數比較差異無顯著性(P>0.05),見圖3a;各組小鼠Shannon指數比較差異具有顯著性(F=7.26,P<0.05),其中C、D組與B組進行比較,Shannon指數均顯著性增高(t=4.33、4.85,P<0.05),見圖3b。

a:基于Chao指數的α多樣性分析,b:基于Shannon指數的α多樣性,c:腸道菌群β多樣性中PCoA分析

小鼠腸道菌群β多樣性中PCoA分析顯示,各組小鼠腸道菌群結構比較差異有顯著性(R=0.29,P<0.05),其中B與A、C、D組完全分開,說明群落結構差異較大(P<0.05),A組與C、D組有重疊且距離較近,說明物種組成結構相似,見圖3c。

2.6 四君子湯對小鼠腸道菌群物種組成的影響

小鼠腸道菌群門水平上物種分析顯示,各組小鼠的腸道菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、彎曲菌門(Campilobacterota)以及放線菌門(Actinobacteriota)等組成,其中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度最高,約占90%。B組與A組比較,厚壁菌門相對豐度下降了9.22%,擬桿菌門相對豐度增加了12.11%,厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)下降了49.73%;D組與B組比較,厚壁菌門相對豐度增加了1.01%,擬桿菌門相對豐度降低了1.00%,F/B比值增加了3.69%。而C組與B組比較,厚壁菌門相對豐度增加了0.94%,擬桿菌門相對豐度增加了1.00%,F/B比值無明顯變化,見圖4a。小鼠腸道菌群屬水平檢測顯示,B組與A組比較,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等相對豐度增加,但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium、norank_f_Lachnospiraceae等的相對豐度降低;C、D組較B組,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等菌屬含量降低,但是Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum、norank_f_Lachnospiraceae等有益菌屬含量增加,且D組病原菌降低以及益生菌增加更明顯,見圖4b。

a:小鼠腸道菌群門水平上物種組成和相對豐度柱狀圖,b:小鼠腸道菌群屬水平上物種組成和相對豐度柱狀圖

3 討 論

歷代醫者認為,酒屬濕熱毒,酗酒則傷及脾、胃、肝、腸等,造成肝氣郁結,脾胃虛弱,氣血不和,生痰積熱。肝脾腸三臟俱損是ALD的重要病機,健脾是疏肝的重要途徑［8］。ALD發病機制之一是酗酒導致腸道微生物變化,與中醫酒濕傷脾有異曲同工之處［9］。四君子湯是健脾祛濕的代表方劑,其調節腸道菌群的作用［10］,可能有助于防治ALD。本研究通過建立小鼠ALD模型,圍繞腸道菌群變化探討四君子湯對小鼠ALD的防治作用。

體質量和臟器指數是反映身體健康狀況的指標之一［11］,而肝臟和脾臟的病理檢查是反映肝脾細胞損傷程度的最直觀的證據,也是臨床診斷常用的金標準［12］。此外血清中ALT、AST、ALP、T-BIL水平反映肝損傷程度,TG和TC水平反映脂質堆積情況。當肝臟受到酒精、病毒等因素刺激后,ALT和AST會大量釋放至血液中［13］。本研究發現,酗酒可導致小鼠肝脾臟器腫大,體質量顯著下降而肝脾指數明顯升高;同時,B組與A組相比較,血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平顯著升高。HE染色結果顯示,B組小鼠肝臟損傷最為嚴重,出現肝索結構紊亂,肝細胞氣球樣變,脾組織細胞結構崩解壞死。油紅O染色顯示,B組小鼠肝臟內呈現油紅O著色,提示肝臟脂肪蓄積和脂肪變性情況嚴重。而四君子湯的干預可增加小鼠的體質量,降低肝脾指數,降低血清中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平,改善肝臟脾臟的病理損傷。表明四君子湯可以對小鼠ALD起到了一定的防治作用。

大量研究證實腸道微生物與ALD發生發展密切相關［14］。由于酒精攝入引起腸道菌群失調,進而導致腸道黏膜屏障受損,腸道通透性增加,從而影響肝臟功能［15］。本研究通過檢測腸道通透性以及腸道菌群變化,來進一步判斷四君子湯是否是通過該途徑改善肝臟損傷。本研究發現B組與A組比較,小鼠腸道通透性顯著增高,與WANG等［16］研究結果類似;而C、D組與B組比較腸道通透性明顯改善。腸道菌群的檢測結果也顯示B組小鼠腸道菌群α多樣性明顯低于A組,與FAN等［17］研究結果相似;C、D組菌群多樣性以及豐富度高于B組。本研究腸道菌群β多樣性分析結果表明,C、D組腸道微生物分布與A組相似度高,且均與B組差異較大,與LENG等［18］研究結果一致。酒精及其代謝產物會影響腸道菌群組成,導致菌群失調［19］。本研究發現,B組較A組在腸道菌群門水平上可使擬桿菌門相對豐度升高,厚壁菌門相對豐度降低,厚壁菌門與擬桿菌門比值降低,與LIU等［20］結果類似;在屬水平上,酒精過量攝入使B組中Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella等菌屬顯著富集但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium的相對豐度降低。其中Prevotella_UCG-001是機會性致病菌,與腸炎、肝炎及代謝紊亂等疾病相關［21］。Alloprevotella屬于革蘭陰性桿菌,與牙周炎、直腸炎等多種疾病相關［22-24］。在給予四君子湯后,腸道微生物變化明顯。D組小鼠腸道菌群門水平上較B組擬桿菌門豐度降低,F/B比值增加;C組較B組厚壁菌門豐度升高,而擬桿菌門也升高,具體機制尚需進一步探討。小鼠腸道菌群屬水平上C、D組較B組Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella菌屬含量降低,推測四君子湯具有緩解腸道炎癥的潛在益處;而Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌屬含量增加;其中D組致病菌降低以及有益菌升高更為顯著。Dubosiella具有參與調節身體代謝、提高腸道免疫力、改善肥胖癥狀以及改善酒精性肝損傷等作用［25］。Bifidobacterium在調節腸道菌群結構、限制腸道潛在致病菌黏附和過度生長、改善腸黏膜屏障功能等方面均能夠發揮重要作用［26］。Allobaculum作為短鏈脂肪酸產生菌在改善腸屏障的完整性方面起著重要作用［27］。本研究結果表明,四君子湯通過改善腸黏膜屏障,降低腸道通透性,調節菌群多樣性,增加Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌,減少致病菌,從而改善酒精性肝損傷,符合“肝病要實脾”的理念。

總之,本研究顯示,四君子湯可有效改善酒精誘導的肝損傷,其作用機制包括改善肝功能、調節脂類代謝、改善腸道黏膜屏障,增加腸道菌群多樣性、提高Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌含量等多種途徑,具有顯著的多途徑、多效應優勢。本研究圍繞腸道菌群變化,揭示四君子湯通過“實脾”達到“治肝”的作用,為探索中藥方劑對酒精性肝病的防治提供了新思路。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已經通過了青島大學附屬醫院實驗動物福利倫理委員會的審核批準(文件號AHQU-MA-L20200626)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》進行。

作者聲明：尤紅娟、韓亞斐、周泉、呂秋蘭參與了研究設計;李筱媛、陳雪紅、姚如永、尤紅娟參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。