松油烯-4-醇與α-紅沒藥醇對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌協同抑菌作用研究

孟昭成 王麗欣 呂雅琳 江水 李振興 陳官芝

(1 青島大學附屬醫院皮膚科,山東 青島 266003; 2 中國海洋大學食品安全實驗室)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)是人類皮膚細菌感染的主要致病菌［1-3］,痤瘡丙酸桿菌(C.acnes)與痤瘡發病機制的多個環節密切相關［4］。目前治療細菌感染的常規方法是使用抗生素,但隨著細菌對抗生素耐藥性的增加［5］,抗生素的替代治療逐漸引起臨床上的重視。植物精油提取自芳香植物中,具有抗菌、抗炎、抗病毒等藥理活性,其抗菌特性不易導致細菌耐藥,在特定領域具有替代抗生素的潛力［6］。松油烯-4-醇(T4O)為茶樹油的主要化合物,在茶樹油中的含量占比超過35%,具有很強的抗菌和抗炎活性,是茶樹油治療尋常痤瘡的重要作用成分［7-9］。α-紅沒藥醇(Bis)最初提取于洋甘菊中,因其具有舒緩皮膚作用,被應用到許多化妝品配方中［10］。此外,Bis還具有抗炎及促進傷口愈合的作用［11］,以及與抗生素諾氟沙星聯合治療S.aureus感染時具有協同作用［12］。目前T4O和Bis均被應用在皮膚外用制劑中,但有關T4O、Bis聯用的抑菌作用則未見報道。本研究通過測定T4O、Bis聯用對S.aureus及C.acnes的抑菌作用,為開發新型抑菌產品成分配方提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

T4O購自上海皓鴻生物醫藥科技有限公司,Bis購自上海麥克林生化科技有限公司,吐溫80、2,3,5-三苯基四氮唑購自北京索萊寶有限公司,鹽酸米諾環素購買于浙江海正輝瑞制藥有限公司,金黃色葡萄球菌(ATCC 43300)、痤瘡丙酸桿菌(ATCC 11827)購自北納創聯生物技術有限公司,MH肉湯培養基(MHB)、營養瓊脂培養基、液體硫乙醇酸鹽培養基(FT)、哥倫比亞血平板購自青島海博生物有限公司。

Sigma3K15離心機購自曦瑪離心機(上海)有限公司,Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀購自英國Malvern公司,NanoDropTMOne微量UV-Vis分光光度計、全自動酶標儀購自美國賽默飛公司。

1.2 S.aureus和C.acnes的培養

將S.aureus菌液在營養瓊脂培養基上畫線接種,于37 ℃恒溫箱中過夜培養,挑取單菌落至裝有MHB的試管中,37 ℃下于200 r/min的搖床中培養至對數生長期以后備用。將C.acnes菌液在哥倫比亞血平板上畫線接種,37 ℃下于厭氧箱中培養48 h,挑取單菌落至裝有FT的試管中, 37 ℃下于厭氧箱中靜置培養至對數生長期后備用。

1.3 T4O與Bis對兩種實驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)的測定和部分抑菌濃度指數(FICI)的計算

將對數生長期的兩種細菌用MHB(S.aureus)和FT(C.acnes)分別稀釋為濃度每升約1×109個菌落形成單位(CFU)的菌懸液。參考BELLIO等［13］的方法,在無菌96微孔板中用MHB將Bis從1～11列進行二倍梯度稀釋,每孔溶液體積為100 μL,使質量濃度分別達到25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05和0.02 g/L;用MHB將T4O從A～G行進行二倍梯度稀釋,使終質量濃度達到10.00、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31和0.16 g/L;在上述各孔中添加100 μLS.aureus懸液,于37 ℃恒溫靜置培養24 h。另外取一塊無菌96微孔板重復上述操作,在各孔中添加100 μLC.acnes懸液,37 ℃下于恒溫靜置厭氧培養48 h。在上述濃度梯度中,肉眼可觀察到的無實驗菌株生長的最低藥物濃度即為MIC。將0.2 mg/g鹽酸米諾環素作為質控藥物,重復上述操作,實驗菌株的MIC在0.05～0.20 mg/L之間,則認為上述實驗測定結果可信。采用FICI判斷T4O與Bis聯用的效果,其計算方法為FICI=MICT4O(聯用)/MICT4O(單用)+MICBis(聯用)/MICBis(單用)。FICI≤0.5為協同作用,0.5～1為相加作用,1～4為無相互作用,≥4為拮抗作用［14］。

1.4 繪制T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株時間-殺菌曲線

將對數生長階段的S.aureus用MHB稀釋至1×109CFU/L,取15 mL菌液4 ℃ 6 000 r/min離心10 min,去除上清液以后加入12 mL MHB并吹打均勻,分別平均分裝至3個無菌試管中,標記為MIC1、2×MIC1及陰性對照1組。另取對數生長階段的C.acnes以FT稀釋至1×109CFU/L后重復上述操作。于S.aureus的MIC1組試管中加入3.13 mg T4O及1 mg Bis,2×MIC1組試管中加入6.25 mg T4O及1 mg Bis;于C.acnes的MIC1組試管中加入1.56 mg T4O及1 mg Bis,2×MIC1組試管中加入3.13 mg T4O及1 mg Bis;兩種菌株的陰性對照1組中均加入7.2 μL生理鹽水。最后所有組中各加入50 μL吐溫80,再用每種菌株對應的培養基補充至總體積均為5 mL,充分振蕩混勻。S.aureus的各組在37 ℃下于200 r/min搖床中培養,C.acnes各組37 ℃下于厭氧箱中靜置培養,每2 h以平板涂布計數法測量一次CFU,觀察24 h并繪制時間-殺菌曲線。實驗重復3次,數據取均值。

1.5 T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株表面Zeta電位(ZP)的影響

將對數生長階段的兩種菌懸液用MHB(S.aureus)和FT(C.acnes)稀釋至1×109CFU/L,使用1.4中方法進行分組,每種菌株均分為MIC2、2×MIC2及陰性對照2組,4 h后每組分別取1 mL菌液,于4 ℃下6 500 r/min離心15 min后。收集菌體用無菌PBS重懸、洗滌2次,用Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀檢測兩種實驗菌株表面ZP。

1.6 T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株細胞內核酸和蛋白質泄漏的影響

將1.5中各組培養4 h后的兩種菌株分別取1 mL,于4 ℃下6 500 r/min離心5 min,取上清液,使用微量UV-Vis分光光度計測定各組上清液在波長260、280 nm處的吸光度(A)值,分別代表菌株細胞內核酸及蛋白質的含量。

1.7 T4O與Bis聯用對S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性的影響

參考NING等［15］的方法檢測呼吸鏈脫氫酶活性。按1.4中方法制備S.aureus的MIC3、2×MIC3及陰性對照3組的菌液,每組取2 mL菌液后均依次加入0.05 mol/L pH 8.6的Tris-HCl緩沖液以及0.1 mol/L葡萄糖溶液和1 g/L 2,3,5-三苯基四氮唑溶液各4 mL, 37 ℃下于200 r/min搖床振蕩4 h后,各組中均加入200 μL濃硫酸終止反應;最后均加入5 mL正丁醇混勻,靜置5 min后6 500 r/min離心5 min,取上清液。使用酶標儀測定各組上清液在波長490 nm處吸光度值;吸光度值越高,代表S.aureus呼吸鏈脫氫酶的活性越高。

1.8 透射電鏡觀察T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株形態的影響

將1.5中各組培養4 h后的兩種菌株分別取1 mL,于4 ℃下以6 500 r/min離心5 min,用無菌PBS洗滌菌體2次,后加入1 mL 25 g/L的戊二醛固定,置于4 ℃冰箱6 h后,使用負染法染色,用透射電鏡觀察菌株形態并拍照。

1.9 T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株細菌生物膜的破壞作用

將對數生長階段的兩種菌懸液分別加到兩塊無菌96微孔板的1～3列中,每孔200 μL,S.aureus在37 ℃下于培養箱中靜置培養72 h后,C.acnes在37 ℃下于厭氧培養箱中靜置培養96 h后,仔細去除菌液后沖洗培養孔3次,去除多余的水分。將T4O與Bis用質量濃度5 g/L的吐溫80-生理鹽水緩沖液按1.4中方法配置,每種菌株均分為MIC4、2×MIC4及陰性對照4組,將各組分別加至上述1～3列微孔中,每孔200 μL, 37 ℃下于恒溫培養箱中靜置24 h。去除微孔中液體,生理鹽水沖洗3次后室溫干燥,向每孔中加入200 μL質量濃度0.1 g/L的結晶紫溶液,于室溫下染色30 min后小心去除染色液并用蒸餾水清洗3次,37 ℃下放置30 min后加入200 μL無水乙醇,用酶標儀測定兩板1～3列在波長595 nm處的吸光度值;吸光度值越高,代表微孔中殘留生物膜越多。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 T4O與Bis單獨及聯用時對兩種實驗菌株的抗菌作用

T4O單獨用藥時對兩種實驗菌株的MIC均為2.5 g/L,聯用時對S.aureus的MIC降至0.62 g/L,對C.acnes的MIC降至0.31 g/L;Bis單獨用藥時對兩種實驗菌株的MIC均>12.5 g/L,聯用時對兩種實驗菌株的MIC降至0.39～1.56 g/L。T4O、Bis聯用時對S.aureus和C.acnes的FICI值均<0.5,表明T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株表現為協同抑制作用。

2.2 T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株的抑制作用

雙因素方差分析結果顯示,組別(藥物濃度)、時間、組別與時間交互作用對于S.aureus和C.acnes的抑制有明顯影響(F組別=208.06、215.92,F時間=56.31、66.23,F組別*時間=63.52、76.15,P<0.01)。Tukey法結果顯示,S.aureus自2 h時及其后各時間點的菌落濃度三組間比較均具有顯著差異(F=25.56～598.17,P<0.05),C.acnes自2 h時及其后各時間點的菌落濃度三組間比較也具有顯著差異(F=39.84～617.08,P<0.05)。見圖1。

2.3 T4O與Bis聯用時對兩種實驗菌株表面ZP的影響

S.aureus的MIC2、2×MIC2組和陰性對照2組菌株表面ZP分別為(-1.060±0.032)、(-1.167±0.072)、(-0.804±0.132)mV,三組間比較差異有顯著性(F=26.57,P<0.01);C.acnes的MIC2、2×MIC2組以及陰性對照2組菌株表面的ZP分別為(-1.223±0.093)、(-1.360±0.185)、(-0.760±0.076)mV,三組間比較差異有顯著性(F=18.29,P<0.05)。

2.4 T4O與Bis聯用對實驗菌株細胞內核酸及蛋白類泄漏的影響

S.aureus的MIC2、2×MIC2組和陰性對照2組A260值分別為0.990±0.147、1.157±0.092、0.687±0.087,A280值分別為1.270±0.076、1.340±0.070、0.963±0.040,三組間A260、A280值比較差異均有顯著性(F=13.50、29.53,P<0.05);C.acnes的MIC2組以及2×MIC2組與陰性對照2組A260值分別為1.155±0.145、1.268±0.170、0.775±0.068,A280值分別為0.930±0.082、1.253±0.076、0.627±0.153,三組間A260、A280值差異均具有顯著性(F=14.67、24.71,P<0.05)。

2.5 T4O與Bis聯用對S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性的影響

S.aureus的MIC3、2×MIC3組和陰性對照3組A490值分別為0.167±0.040、0.109±0.025、0.761±0.087,三組之間A490值比較差異具有顯著性(F=120.80,P<0.01)。

2.6 透射電鏡觀察T4O與Bis聯用對兩種實驗菌株形態的影響

S.aureus的陰性對照2組菌株可見細胞完整,胞質均勻;MIC2組處理4 h后,可見細菌細胞中央凹陷,顏色變淡,說明細胞膜遭到破壞,胞內物質外流。C.acnes的陰性對照2組菌株可見細胞完整,胞膜清晰;MIC2組處理4 h后,可見細菌細胞邊界模糊,菌體粗細不均勻。見圖2。

圖2 經T4O和Bis聯合處理的S.aureus及C.acnes透射電鏡圖像

2.7 T4O與Bis聯用對于實驗菌株生物膜的破壞作用

S.aureus的MIC4、2×MIC4組與陰性對照4組生物膜染色液A595值分別為0.272±0.032、0.229±0.023、0.426±0.037,三組間A595值進行比較差異有顯著意義(F=44.41,P<0.01);C.acnes的MIC4、2×MIC4組與陰性對照4組生物膜染色液A595值分別為0.333±0.081、0.310±0.073、0.466±0.069,三組之間A595值進行比較差異具有顯著性(F=5.12,P<0.05)。

3 討 論

已有報道指出,T4O對S.aureus和C.acnes具有明確的抑制作用［16-18］,文獻關于T4O抗S.aureus作用的MIC為1.25～2.50 g/L［19］,與本研究結果相符。本研究T4O與Bis聯用時,T4O對S.aureus以及C.acnes的MIC分別為0.62、0.31 g/L。Bis為0.39、0.78、1.56 g/L三個濃度時對兩種菌株均產生抑制作用,其余濃度對兩種菌株均無抑制作用,因此Bis的MIC為0.39～1.56 g/L,即藥物濃度過高或者過低均會降低兩藥的協同抑菌效果,并且Bis的抗炎作用也有類似的最佳濃度范圍［20］。綜合兩種實驗菌株的時間-殺菌曲線可發現,T4O與Bis聯用時對兩種菌株抑制效果與藥物濃度呈現劑量依賴關系,二者在MIC時對兩種實驗菌均有抑菌及部分殺菌作用,2倍MIC時對C.acnes有完全殺菌作用,但不能完全殺滅S.aureus。雖然兩藥聯用時2倍MIC的抑菌效果更佳,但是MIC也可提供長達24 h的持續抑菌作用,故本研究透射電鏡只觀察兩藥濃度為MIC時對兩種細菌抑制作用的影響。

細菌表面電位是維持最佳細胞功能的關鍵物理特征,ZP測量技術可被視為計算細菌表面電位的間接工具。本研究發現,T4O與Bis聯用通過降低兩種實驗菌的ZP發揮抑制作用,CUTRO等［21］同樣發現精油能夠降低細菌的ZP值。呼吸鏈是細菌能量代謝的重要環節,2,3,5-三苯基四氮唑可以與細菌中呼吸鏈脫氫酶發生還原反應,轉變為最大吸收峰在波長490 nm處的紅色物質,故認為A490值與呼吸鏈脫氫酶活性呈正相關［22］。且由于C.acnes為厭氧菌,體內缺乏呼吸鏈脫氫酶,故本研究僅針對S.aureus進行了呼吸鏈脫氫酶活性的檢測。本研究結果顯示MIC3組A490值較陰性對照3組顯著降低,說明兩藥聯用且濃度為MIC時即可抑制S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性。

周靜等［18］使用形態學觀察法直觀地發現T4O可使S.aureus及C.acnes干癟皺縮、出現畸形,從而達到抑制作用。本研究通過透射電鏡觀察,發現T4O、Bis聯用后兩種菌體結構相對完整,但其內容物減少,結合MIC2組A260、A280值較陰性對照2組顯著升高,說明MIC2組兩種菌株細胞內核酸、蛋白泄漏增加,推測這種改變可能是由于細菌膜變得滲透性更高導致。使用結晶紫對微量滴定板孔內形成的生物膜染色是分析生物膜形成、抑制或根除的最常用定量方法,本研究中MIC4組A595值較陰性對照4組顯著降低,表明對應的微孔內生物膜含量明顯減少,可以推斷兩藥聯用且濃度為MIC時即可明顯破壞兩種細菌的生物膜。

目前研究發現,S.aureus及C.acnes抗藥性的機制主要為發生基因突變和形成生物膜等［23］。本研究驗證的T4O聯合Bis的協同抗菌作用機制與其他植物精油單體成分的抑菌機制類似,均可破壞細菌細胞膜結構和生物膜,從而減少細菌耐藥性的產生。本實驗所用菌株S.aureus標準菌株ATCC 43300是耐甲氧西林的S.aureus,而C.acnes標準菌株ATCC 11827并非耐藥株,并且缺少在臨床患者皮損中分離耐藥菌株的進一步驗證,但從聯用抑菌機制上推測,對臨床分離的耐藥株也應有類似的抑制作用。FORRER等［24］報道口臭相關的細菌摩爾梭桿菌對茶樹油和Bis聯用敏感,認為該化合物組合可以開發口腔保健產品。綜上所述,本研究發現T4O與Bis聯用的抑菌潛力,兩者或有望成為針對皮膚S.aureus及C.acnes感染治療產品的配方組合成分。

作者聲明：孟昭成、李振興、呂雅琳參與了研究設計;孟昭成、陳官芝、王麗欣、江水參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。