吲哚-2,3-二酮對SH-SY5Y細胞增殖與遷移的影響及其機制

仇碧茹 侯琳 張麗 牛婷婷 宋軍瑩

(1 青島大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系,山東 青島 266071; 2 青島大學藥學院; 3 青島大學附屬醫院乳腺外科)

神經母細胞瘤起源于交感神經系統［1-2］,常用的治療手段有化療、手術切除、高劑量化療聯合自體干細胞挽救(ASCR)等［3］。然而臨床常用的化學合成藥物具有毒副作用大、治療效果不佳且伴有明顯的骨髓抑制等缺點［4］,從而限制了這些化學合成藥物的臨床應用。

吲哚-2,3-二酮(ISA)是天然存在于自然界的吲哚類化合物,是我國獨創Ⅰ類天然抗癌新藥靛玉紅的單體結構,具有抗病毒、抗腫瘤等作用［5-7］。Janus激酶(JAK)屬于酪氨酸激酶家族,由TYK2、JAK1、JAK2、JAK3 4個成員組成。JAK2作為多種生長因子和細胞因子激活信號通路的調節器,在多種細胞類型中高表達［8］。研究發現,激活JAK2/STAT3信號通路可促進多種人類腫瘤如膠質母細胞瘤、肺癌、肝癌等的發生和進展［9-10］,阻斷該通路可抑制細胞增殖,并誘導腫瘤細胞的凋亡［11-13］。本研究通過探討ISA對神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞抗腫瘤的作用及機制,旨在為神經母細胞瘤的治療提供有益的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體

神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中科院上海細胞庫,ISA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;GAPDH抗體、p-JAK2抗體、p-STAT3抗體、Bax抗體、Bcl2抗體購買于英國Abcam公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒、PI染色液、牛血清白蛋白(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

使用DMEM高糖培養基+體積分數0.10的胎牛血清+青鏈霉素混合溶液(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)配置完全培養基,然后將SH-SY5Y細胞養于含有完全培養基的細胞培養瓶中,并置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中培養,待細胞進入對數生長期后,進行后續實驗。

1.3 CCK-8實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響

將對數生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板中,每孔1 000～2 000個細胞,向每孔中加入含不同濃度 (0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L) ISA的完全培養基,放入37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養48 h后,向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續孵育2 h。酶標儀測量波長450 nm的各孔吸光度(A)值,計算不同濃度下細胞活力及半致死濃度(IC50值)。

1.4 平板克隆實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞克隆形成能力的影響

將對數生長期的SH-SY5Y細胞接種于6孔板中,每孔約500個細胞,置于培養箱中培養24 h后,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組),培養箱中培養1～2周,孔中可見克隆形成時終止培養。甲醇固定細胞15 min,棄固定液,結晶紫染色細胞10 min,洗去染色液,自然風干。肉眼計數克隆數,計算克隆形成率。

1.5 劃痕實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞遷移能力的影響

將對數生長期的SH-SY5Y細胞接種于內含完全培養基的6孔板中,每孔約50 000個細胞,當細胞融合度約為90%時,用200 μL槍頭垂直于培養板進行劃痕。用PBS清洗細胞3次后,每孔加入2 mL無血清培養基,并分別加入含有0、50、100及200 μmol/L ISA(A～D組)無血清培養基繼續培養。于第0、12、24和48小時時顯微鏡下拍照,計算劃痕面積。

1.6 ISA對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

將對數生長期的SH-SY5Y細胞,接種于6孔板中,每孔約10 000個細胞,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組),培養48 h后。按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的操作要求,用流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測,并計算細胞凋亡率。

1.7 ISA對SH-SY5Y細胞周期的影響

將處于對數生長期的SH-SY5Y細胞培養于細胞培養瓶中,分別加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D組)的完全培養基,置于培養箱中培養48 h后,按照PI染色試劑盒說明書對細胞進行處理,用流式細胞儀進行細胞周期的檢測,計算G1期細胞構成比。

1.8 Western blot 實驗檢測ISA對SH-SY5Y細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白相對表達量的影響

收集終濃度為0、50、100、200 μmol/L ISA處理48 h后的SH-SY5Y細胞(A～D組),RIPA裂解液處理后提取總蛋白,BCA法測蛋白濃度后進行電泳,PVDF轉膜后用封閉液室溫封閉2 h,TBST清洗3次,一抗孵育過夜,TBST清洗3次,二抗孵育1 h。按ECL發光液說明書孵育PVDF膜,成像儀顯影并拍照。以GAPDH的條帶結果為內參照,將目的蛋白與內參的條帶進行比較,以計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法

2 結 果

2.1 ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響及其IC50值

CCK-8實驗結果顯示,以終濃度為0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L的ISA處理SH-SY5Y細胞48 h以后,SH-SY5Y細胞的細胞活力分別為(100.00±0.73)%、(97.56±0.58)%、(95.10±0.55)%、(90.00±1.04)%、(86.62±0.39)%、(84.29±0.77)%、(80.26±0.93)%、(69.97±0.91)%、(62.71±1.04)%、(57.48±1.04)%、(40.33±1.04)%、(22.68±0.79)%,隨著ISA濃度的遞增,SH-SY5Y細胞的活力逐漸下降(F=1 632.62,P<0.05)。計算得到ISA作用SH-SY5Y細胞48 h后的IC50值為300 μmol/L,小于IC50值的濃度對細胞沒有毒性,故后續的實驗選用的ISA濃度為0、50、100、200 μmol/L。

2.2 各組SH-SY5Y細胞集落形成能力的比較

平板克隆實驗的結果顯示,A～D組的克隆形成率分別為(100.00±1.99)%、(79.88±1.32)%、(52.82±1.09)%、(25.75±1.08)%,隨著ISA濃度的增加,SH-SY5Y細胞的集落形成能力逐漸下降(F=1 038.21,P<0.05),各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=11.91～46.43,P<0.05)。

2.3 各組SH-SY5Y細胞遷移能力的比較

重復測量設計的方差分析結果顯示,組別、時間及組別和時間的交互作用對SH-SY5Y細胞遷移能力均具有明顯影響(F組別=379.00,F時間=291.00,F組別*時間=2.84,P<0.05);單獨效應分析結果顯示,隨著時間的延長,A～D組SH-SY5Y細胞的遷移能力逐漸增強(F=94.83～153.77,P<0.05),同一組內不同時間點兩兩比較差異均具有顯著性(t=5.90～23.14,P<0.05),不同時間點各組之間整體比較差異有顯著性(F=39.87～222.00,P<0.05),各組之間兩兩比較差異也具有顯著意義(t=3.57～34.28,P<0.05)。見表1。

表1 各組SH-SY5Y細胞遷移率比較

2.4 各組SH-SY5Y細胞凋亡率的比較

檢測結果顯示,A～D組的凋亡率分別為(4.29±0.17)%、(6.16±0.21)%、(8.74±0.34)%、(17.01±0.51)%,隨著ISA濃度的升高,細胞的凋亡率逐漸升高(F=557.71,P<0.05),各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=9.06～33.41,P<0.05)。

2.5 各組SH-SY5Y細胞中G1期細胞構成比比較

檢測結果顯示,A～D組的G1期細胞構成比分別為(35.33±1.17)%、(42.59±0.13)%、(54.04±0.21)%、(58.09±0.13)%,隨著ISA濃度的升高,SH-SY5Y細胞G1期細胞構成比顯著性增高(F=632.38,P<0.05),各組間兩兩比較差異具有顯著性(t=8.67～123.68,P<0.05)。

2.6 各組SH-SY5Y細胞中Bax、Bcl2及p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量比較

實驗結果顯示,A～D組Bax的蛋白相對表達量隨ISA濃度的增高明顯升高(F=464.50,P<0.05),而p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白相對表達量隨ISA濃度的升高明顯降低(F=286.56～541.13,P<0.05),各組間兩兩比較,上述4種蛋白的表達差異均具有顯著性(t=5.75～50.46,P<0.05)。見表2。

表2 各組SH-SY5Y細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白的相對表達量比較

3 討 論

腫瘤侵襲和轉移是一個高度有序、非隨機、器官選擇性的過程,涉及一系列復雜的步驟［14］。神經母細胞瘤的相關性死亡大多數發生于淋巴結和骨骼轉移［15］。因此,抑制癌細胞侵襲和遷移對于腫瘤的治療至關重要［16］。

隨著細胞生物學、腫瘤基因學研究的不斷深入,尋找作用效果好、毒副作用低、特異性強的新型抗腫瘤藥物已成為當今抗腫瘤藥物研究的重要發展方向。近年來,全球的目光紛紛聚集于能夠直接靶向作用腫瘤細胞、對正常細胞損傷較小的天然小分子化合物類藥物(如長春堿、長春新堿等)的研究。ISA作為天然吲哚類化合物［16］,具有多種藥理學活性,如神經保護、抗菌和抗病毒等活性［17］。既往研究發現,ISA還具有促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用［18-20］。

JAK2是一種廣泛表達的非受體蛋白酪氨酸激酶,可作為多種生長因子(包括白細胞介素、干擾素、生長激素、促紅細胞生成素和瘦素)和細胞因子受體激活的信號通路的調節器。JAK2可由多種細胞因子(包括生長激素、干擾素γ)、生長因子(包括EGF和PDGF)和GPCR配體激活,并參與細胞的增殖與遷移。

JAK2激活STAT3后,被激活的STAT3轉移到細胞核中,進一步激活各種靶基因的轉錄［21-23］。STAT3作為眾多致癌信號通路的匯合點,在腫瘤形成中發揮著重要的作用。大量證據表明STAT3可參與細胞凋亡以及腫瘤細胞的增殖和侵襲［1］。既往的研究表明,在神經母細胞瘤中,腫瘤細胞的遷移可能與p-STAT3的表達下降有關［24］。p-STAT3是STAT3的活化形式,異常的STAT3信號傳導是腫瘤惡性進展的關鍵過程,并由JAK2誘導［24］。

針對神經母細胞瘤增殖能力強、易轉移的特性,本研究對ISA在神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中的抑制作用進行了深入探究。通過CCK-8實驗檢測不同濃度ISA對SH-SY5Y細胞活力的影響,結果顯示隨著ISA濃度的升高,SH-SY5Y細胞活力逐漸下降,計算得出ISA作用于SH-SY5Y細胞48 h的IC50值為300 μmol/L,小于IC50值的濃度對細胞沒有毒性,因此選用0、50、100、200 μmol/L為后續實驗的濃度。本研究采用平板克隆實驗、劃痕實驗分別檢測ISA對SH-SY5Y細胞克隆形成能力和遷移能力的影響,結果顯示不同濃度的ISA處理SH-SY5Y細胞后,隨著ISA濃度的增加,細胞的克隆形成率和遷移率均明顯下降,這表明ISA顯著抑制了SH-SY5Y細胞的克隆形成能力和遷移能力。當腫瘤細胞的凋亡機制被破壞,細胞生長不再受到限制時,腫瘤便會隨之發生和發展。若能夠重新激活腫瘤細胞的凋亡機制,就有望實現治療腫瘤的目標。細胞周期在抗癌藥物篩選中是一個主要的關注點,細胞生長需要經歷G1、S、G2與M期,細胞從G1進入S期為關鍵點,決定了細胞周期能否繼續。為了探究ISA對SH-SY5Y細胞的凋亡和細胞周期的影響,本研究采用Annexin V-FITC/PI試劑和PI染色流式細胞儀分別檢測ISA對SH-SY5Y細胞的凋亡和細胞周期的影響,結果顯示不同濃度的ISA作用于SH-SY5Y細胞后,隨著ISA濃度的增高,SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯升高,且G1期細胞構成比顯著增高。Bax和Bcl2同屬于Bcl2家族,Bax為促細胞凋亡的因子,而Bcl2為抗細胞凋亡因子,均為參與細胞凋亡的重要生物學因子。JAK2、STAT3作為JAK2/STAT3通路的重要成員,p-JAK2以及p-STAT3的表達水平變化可反映ISA能否通過此信號通路發揮抑制腫瘤發生與發展的作用。本研究Western blot實驗結果表明,SH-SY5Y細胞中的Bax的蛋白相對表達量隨ISA濃度的增高明顯升高,而p-JAK2、p-STAT3和Bcl2蛋白相對表達量隨ISA濃度的升高明顯下降,表明ISA可以促進Bax蛋白表達,同時抑制p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白的表達。

綜上所述,本研究結果顯示,ISA對神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的增殖與遷移具有顯著的抑制作用,其抑制作用可能是通過JAK2/STAT3通路實現。ISA有望為神經母細胞瘤的臨床治療提供新的思路,具有樂觀的應用前景。

作者聲明：仇碧茹、侯琳、張麗參與了研究設計;仇碧茹、牛婷婷、宋軍瑩參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。