腺苷A2a受體激動劑對膿毒癥急性腎損傷中內質網應激的調節作用

王靜靜, 巴音查汗·博然衣, 郭峻氚

(新疆維吾爾自治區人民醫院重癥醫學科, 新疆 烏魯木齊 830000)

膿毒癥是一種復雜的臨床綜合征,由宿主對感染的反應失調引起,會引起全身炎癥反應,并導致廣泛的組織損傷和多器官功能障礙[1]。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥進展過程中最常見和最嚴重的并發癥之一,據統計,高達60%的膿毒癥病例并發AKI,這不僅易發展為慢性腎臟病,并大大增加了患者的死亡風險[2]。然而,膿毒癥AKI致病機制復雜,發生發展涉及多種因素,目前尚無有效預防或治療藥物,因此,尋求該疾病的有效治療手段十分關鍵。腺苷是一種內源性核苷,通過G蛋白偶聯腺苷受體發出信號來控制細胞功能。目前已確定腺苷受體四種亞型:A1、A2a、A2b、A3,不同受體在各種病理生理條件下發揮重要作用。其中,腺苷A2a受體對腺苷具有很高的親和力,可在肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、T細胞和血小板上表達,先前已有研究表明,當該受體被激活后可以抑制T細胞增殖和促炎因子的產生,有助于抗炎因子的合成,從而在多種炎癥性疾病中起著關鍵的調節功能,因而在膿毒癥治療中具有很大潛力。但腺苷A2a受體在膿毒癥中的研究尚處于臨床前研究階段,關于膿毒癥相關AKI的研究報道也很少。CGS21680是腺苷A2a受體的高效激動劑,已被證實能夠抑制多種炎性細胞的聚集及其介質釋放[3]。基于此,本研究通過構建膿毒癥誘導AKI大鼠模型,探討腺苷A2a受體激動劑CGS21680能否減輕大鼠腎損傷,并對作用機制進行了初步探究。現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠:40只健康SD大鼠,雄性,體質量180g～230g,購于新疆醫科大學實驗動物中心。大鼠在動物實驗中心飼養,溫度控制在23℃～25℃,相對濕度為55%,12h光暗循環,自由飲食、飲水,適應性飼養一周后開始實驗。

1.2主要試劑:腺苷A2a受體激動劑CGS21680(美國Sigma Aldrich公司),水合氯醛(北京康瑞納生物公司),封閉山羊血清原液(上海酶研生物科技公司),SCr、BUN、KIM-1和NGAL檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),HE染色液和PAS染色液(北京凱詩源生物公司),TUNEL細胞凋亡染色試劑盒、DAPI染料、RIPA裂解液及ECL試劑(上海碧云天生物研究所),DAB顯色試劑盒(北京普非生物科技公司),BCA蛋白檢測試劑盒(北京康為世紀公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG與兔抗GRP78、CHOP、MCP-1抗體(英國Abcam公司),兔抗GAPDH、XBP1、PERK、p-eIF2α及eIF2α抗體(美國Santa Cruz 公司)。

1.3方 法

1.3.1動物分組、造模及給藥:將40只SD大鼠按數字隨機表法分為對照組、腺苷A2a受體激動劑(CGS21680)組、模型(AKI)組、腺苷A2a受體激動劑干預(CGS21680+AKI)組,每組10只。除對照組外,其余3組大鼠均建立AKI模型,術前1h,CGS21680組和CGS21680+AKI組腹腔注射CGS21680(2.1mg/kg),對照組和AKI組腹腔注射等量生理鹽水。AKI模型制備參考文獻[4]方法操作,對照組大鼠僅開腹分離,不結扎、不穿孔。

1.3.2血清生化指標測定:1周后麻醉各組大鼠,尾靜脈取血,室溫靜置2h,置于低溫離心機通過3000 r/min離心15min,收集上清液,保存于-20℃備用。全自動生化分析儀測定血清SCr和BUN水平,ELISA法檢測血清KIM-1和NGAL水平,實驗均嚴格根據試劑盒說明書步驟操作。

1.3.3HE染色:各組大鼠采血結束后,解剖摘取腎臟組織,生理鹽水清洗干凈,4%多聚甲醛浸泡固定過夜。修剪固定好的組織,常規石蠟包埋,脫水與透明,切成5μm厚的組織切片,進行HE染色。染色后,中性樹膠封片,通過光學顯微鏡觀察腎臟病理變化并采集圖像。

1.3.4PAS染色:取制備的各組大鼠腎組織石蠟切片進行脫蠟水化,置于阿利新藍液中浸泡10min,流水沖洗,加入過碘酸處理5min,雪夫希夫染色10min,流水再次沖洗,蘇木素復染,1%酸性乙醇分化,加入氨水返藍,流水沖洗,脫水與透明,中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察腎臟病理變化并采集圖像。

1.3.5TUNEL染色:各組大鼠腎組織石蠟切片經過脫蠟水化后,室溫下加入20μg/mL蛋白酶K作用15min, PBS沖洗,將蛋白酶K清洗干凈。吸取適量TUNEL工作液滴于切片上,置于37℃濕盒內染色1h。室溫避光環境下,滴加DAPI染核10min,脫水與透明。用抗熒光淬滅封片液封片,通過熒光顯微鏡觀察并采集圖像,鏡下TUNEL陽性即凋亡細胞呈綠色熒光,隨機選擇6個視野,統計該視野下TUNEL陽性數目與總細胞數目,兩者之比記為TUNEL陽性細胞率(%)。

1.3.6免疫組化染色:各組大鼠腎組織石蠟切片經脫蠟水化、檸檬酸鹽緩沖液加熱修復,3%H2O2孵育10min,以5%山羊血清作封閉液室溫處理2h。將切片分別與兔抗GRP78、CHOP、MCP-1多克隆抗體(均按1∶500稀釋)放于4℃冰箱內共孵育過夜。次日,PBS沖洗,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(按1∶1000稀釋),室溫下再孵育1h,PBS沖洗后,根據DAB試劑盒顯色,蘇木精復染,滴加中性樹膠進行封片。在光學顯微鏡下觀察并采集圖像,鏡下胞質有黃棕色至棕色顆粒沉積即為陽性,隨機選擇6個視野,Image J軟件測量蛋白陽性表達面積占比。

1.3.7Western blot法:RIPA裂解液提取各組大鼠腎組織總蛋白,BCA法測定樣品濃度。以蛋白質量為50μg計算各蛋白體積,加入緩沖液后加熱煮沸,使蛋白變性。配置10%聚丙烯酰胺凝膠,將變性后的蛋白上樣至膠孔,固定電泳裝置,恒壓電泳分離蛋白并轉至PVDF膜。加入5%山羊血清室溫封閉1h,將印跡與稀釋后的一抗XBP1、PERK、p-eIF2α、eIF2α、MCP-1(1∶1000)置于4℃搖床共孵育過夜。TBST洗膜,加入對應稀釋的二抗(1∶5000),室溫下孵育1h,TBST再次清洗,ECL顯影,凝膠成像儀進行可視化,以GAPDH作為內參蛋白,Image J軟件分析條帶灰度值,蛋白相對表達量以目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比來表示。

2 結 果

2.1各組大鼠血清生化指標水平比較:與對照組比較,CGS21680組大鼠血清SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平未發生統計學變化(P>0.05),AKI組SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平均較對照組顯著升高(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平均顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清SCr BUN KIM-1及NGAL水平比較

2.2各組大鼠腎組織病理學變化觀察:HE染色與PAS染色結果顯示,對照組和CGS21680組的大鼠腎組織未見病理學改變,組織結構完整。AKI組大鼠腎小管擴張、變性,腎間質加寬,腎小球水腫,基底膜明顯增厚,有核細胞數目增加。CGS21680+AKI組大鼠腎損傷程度較AKI組明顯減輕。見圖1和圖2。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態學變化觀察(HE,×100)

圖2 各組大鼠腎組織病理形態學變化觀察(PAS,×100)

2.3各組大鼠腎組織內細胞凋亡比較:TUNEL染色統計結果顯示,對照組和CGS21680組的大鼠腎組織內TUNEL陽性率之間差異無統計學意義(P>0.05),AKI組TUNEL陽性率顯著高于對照組(P<0.05)。CGS21680+AKI組TUNEL陽性率則又顯著低于AKI組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細胞凋亡檢測(TUNEL,×100)

2.4各組大鼠腎組織內質網應激水平變化比較:免疫組化染色結果顯示,GRP78與CHO陽性表達主要分布于細胞漿,與對照組比較,CGS21680組大鼠腎組織GRP78、CHOP陽性表達比例未發生統計學變化(P>0.05),AKI組GRP78、CHOP陽性表達比例均顯著高于對照組(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組GRP78、CHOP陽性表達比例均顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織GRP78與CHOP陽性表達檢測(免疫組化,×100)

Western blot測定結果顯示,與對照組比較,CGS21680組大鼠腎組織XBP1、PERK蛋白相對表達量及eIF2α/p-eIF2α比值未發生統計學變化(P>0.05),AKI組XBP1、PERK蛋白相對表達量及eIF2α/p-eIF2α比值均顯著上調(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組XBP1、PERK蛋白相對表達量及eIF2α/p-eIF2α比值顯著下調(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織XBP1、PERK、p-eIF2α及eIF2α蛋白表達水平比較

2.5各組大鼠腎組織MCP-1表達比較:免疫組化染色結果顯示,MCP-1陽性表達主要分布于細胞漿,與對照組比較,CGS21680組大鼠腎組織MCP-1陽性表達比例未發生統計學變化(P>0.05),AKI組MCP-1陽性表達比例均顯著上調(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組MCP-1陽性表達比例均顯著下調(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠腎組織MCP-1陽性表達檢測(免疫組化,×100)

Western blot測定結果顯示,與對照組比較,CGS21680組大鼠腎組織MCP-1蛋白相對表達量未發生統計學變化(P>0.05),AKI組MCP-1蛋白相對表達量顯著上調(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組MCP-1蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠腎組織MCP-1蛋白表達檢測

3 討 論

目前,腺苷A2a受體激動劑作為一種新型炎癥調節劑,在多種疾病中抗炎效果十分突出,在自身免疫性疾病、心血管疾病和癌癥中均發揮作用。研究表明,在大鼠脛骨骨折模型中局部植入含有腺苷A2a受體激動劑CGS21680的纖維蛋白凝膠后,降低了骨折大鼠血液和骨折區域的IL-6水平,調節Treg/Th17細胞趨于平衡,從而促進骨折愈合;在腦缺血模型沙鼠給予腺苷A2a受體激動劑聚脫氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide,PDRN)處理后,抑制了促炎細胞因子的分泌和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號途徑的激活,改善神經元細胞存活,并防止腦缺血動物模型中短期記憶的下降;此外,腺苷A2a受體激動劑CGS21680可減輕缺血再灌注介導的組織損傷,并改善同種異體原位肝移植的功能恢復,提高移植動物模型的存活率[5,6]。本研究結果顯示,腺苷A2a受體激動劑CGS21680處理下的膿毒癥AKI大鼠腎組織損傷明顯減輕,血清中腎功能損害相關指標SCr、BUN、KIM-1、NGAL水平均降低,腎組織內細胞凋亡減少。由此說明,腺苷A2a受體激動劑CGS21680對膿毒癥誘導的AKI大鼠發揮保護作用。

在病理條件下,細胞可能會失去蛋白質平衡,導致內質網中未折疊和錯誤折疊的蛋白質積累,從而觸發未折疊蛋白質反應或內質網應激。在輕度內質網應激下,細胞激活未折疊蛋白質反應以恢復蛋白質平衡,促進細胞存活并增強細胞承受應激的能力。然而,一旦內質網應激過度,未折疊蛋白質反應的適應能力就會不堪重負,導致細胞凋亡程序啟動,來消除不可逆的受損細胞,進而造成組織損傷。多項研究證實,內質網應激參與膿毒癥過程并導致腎組織損傷,內質網應激標志物GRP78和CHOP在膿毒癥AKI腎組織中表達升高,并后續誘導腎小管上皮細胞凋亡[7]。提示內質網應激是膿毒癥AKI臨床防治的潛在新靶點。XBP1是一種獨特的堿性區域亮氨酸拉鏈轉錄因子,其活性形式是由內質網平衡破壞和未折疊蛋白反應激活時的非常規剪接反應產生的,也是內質網應激誘導蛋白表達的關鍵引發劑[8]。PERK是一種位于內質網上的I型跨膜蛋白,在ER應激條件下,PERK在與腔內伴侶GRP78解離后激活,激活的PERK通過使起始因子eIF2α失活來抑制蛋白質向內質網的翻譯,導致蛋白質合成減少,這種抑制作用有助于通過減少錯誤折疊或未折疊蛋白質進一步流入內質網來抑制內質網應激[9]。本研究結果顯示,經過腺苷A2a受體激動劑CGS21680處理的膿毒癥AKI大鼠腎組織中GRP78和CHOP蛋白表達下降,同時,腎組織內XBP1、PERK蛋白表達及eIF2α/p-eIF2α比值也下調。這一研究結果說明了腺苷A2a受體激動劑CGS21680能夠抑制膿毒癥AKI模型大鼠機體內質網應激,發揮腎組織保護作用。

單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)也稱為趨化因子配體2,通過將單核細胞、巨噬細胞等募集到損傷組織或感染部位發揮促炎作用。已有研究表明,MCP-1在膿毒癥AKI患者血清中明顯偏高,不僅與疾病嚴重程度顯著相關,還與機體炎癥反應和免疫反應密切相關,因而在膿毒癥AKI病理機制中至關重要,推測其可能成為膿毒癥AKI診療的靶點[10]。本研究發現,膿毒癥AKI大鼠腎組織中MCP-1表達也升高,而經過腺苷A2a受體激動劑CGS21680處理的膿毒癥AKI大鼠腎組織中MCP-1表達明顯降低,由此提示,腺苷A2a受體激動劑CGS21680對膿毒癥AKI模型大鼠的保護作用是通過降低MCP-1表達水平實現的,這可能是腺苷A2a受體激動劑的作用機制之一。

綜上所述,腺苷A2a受體激動劑CGS21680能夠顯著減輕膿毒癥AKI模型大鼠的腎損傷,機制可能與其抑制內質網過度應激、降低MCP-1表達水平有關。但腺苷A2a受體調節炎癥反應的藥理作用多樣,是否涉及其他作用機制仍需進一步進行探討,以期為該藥物的臨床應用研究奠定基礎。