金雀異黃酮抑制OPN-FAK信號通路對非小細胞肺癌遷移和侵襲的影響

張 田, 任 丹, 李 杰

(1.陜西省咸陽市第一人民醫院, 陜西 咸陽 712000 2.湖北省第三人民醫院腫瘤科, 湖北 武漢 430030)

據統計肺癌是中國乃至全世界發病率、死亡率最高的癌種,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占85%,大多數患者就診時已處于中晚期[1]。NSCLC的發病機制是一個多因素引發的復雜過程,但就目前治療方案,NSCLC的5年生存率為16%[2]。因此需要深入探索NSCLC機制,以尋找高效治療藥物。金雀異黃酮(genistein,GS)屬于異黃酮類,是一種存在于大豆中的天然植物雌激素,具有多種生物學作用,例如抗氧化、抗增殖,其作為抗腫瘤分子在各種癌癥中也發揮著關鍵作用[3]。如GS通過調節黏著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)蛋白抑制宮頸癌HeLa細胞的遷移和侵襲,但其在NSCLC的研究中甚少報道[4]。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種磷酸化的糖蛋白,參與調節細胞黏附、遷移和侵襲。研究表明OPN水平在許多腫瘤如胰腺癌、結腸癌、NSCLC表達異常,可能與腫瘤進展及預后不良有關[5]。據報道FAK信號通路的激活對于OPN調節細胞遷移、侵襲至關重要[6]?；谝陨习l現,本研究推測GS可能通過抑制OPN/FAK信號通路參與NSCLC的遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1細胞來源:四種NSCLC細胞系(H596、H520、A549、H1703)及正常人肺上皮細胞(BEAS-2B)均購自美國典型培養物保藏中心。將細胞置于DMEM培養基中,于5% CO2和37℃的培養箱中培養細胞。

1.2主要材料、儀器:R&D Systems提供重組骨橋蛋白(rOPN);西安澤朗生物科技有限公司提供GS;Corning公司提供Transwell小室;BD Biosciences提供Matrigel溶膠、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒;Invitrogen公司提供TRIzol試劑;碧云天生物科技有限公司提供結晶紫染色液、BCA測定試劑盒;EMD Millipore公司提供PVDF膜;Sigma-Aldrich提供MTT試劑;美國思拓凡公司提供DMEM培養基,Abcam公司提供OPN、p-FAK、FAK一抗。Olympus公司提供光學顯微鏡;美國Thermo公司提供CO2培養箱。

1.3qRT-PCR檢測四種肺癌細胞系及BEAS-2B細胞中OPN、FAK mRNA表達水平:使用TRIzol試劑從H596、H520、A549、H1703、BEAS-2B細胞中提取總RNA,并使用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。用于逆轉錄定量聚合酶鏈反應的引物序列見表1。參照實時PCR系統說明書操作步驟進行定量PCR反應。以GAPDH為內部對照,2-ΔΔCt法分析OPN、FAK mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4細胞分組及處理:將A549細胞分別接種在不同孔板中,設置分組為對照組、GS低濃度(GS-L)組、GS中濃度(GS-M)組、GS高濃度(GS-H)組、rOPN組、GS-H+rOPN組。對照組不做任何處理;GS-L組以10μmoL/L GS處理細胞48h;GS-M組以20μmoL/L GS處理細胞48h;GS-H組以40μmoL/L GS處理細胞48h[7];GS-H+rOPN組同時以15ng/mL rOPN、40μmoL/L GS處理細胞48h;rOPN組以15ng/mL rOPN處理細胞48h[8]。

1.5MTT法檢測細胞增殖率:將A549細胞以每孔2×103個細胞的密度接種在96孔板中。按照上述1.4分組處理細胞后,向每個孔中加入20μL的5mg/mL MTT溶液。孵育4h后,去除孔中的上清液,加入100μL DMSO溶液使晶體完全溶解。通過酶標儀測量490nm處的光密度(OD)值,計算增殖率。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡:使用胰蛋白酶消化A549細胞,用冰冷的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,并以1×106個細胞/mL的濃度重懸于緩沖液中。取100μL溶液轉移到5mL培養管中,然后加入5μL PI和5μL FITC Annexin V。避光條件下室溫孵育15min后,將400μL Binding Buffer添加到每管,并通過流式細胞儀分析凋亡變化。

1.7qRT-PCR檢測A549細胞中OPN、FAK mRNA表達水平:操作步驟同上述1.3。

1.8劃痕試驗檢測細胞遷移率:將A549細胞以每孔6×105個細胞密度接種在6孔板中。用無菌移液管尖端進行劃痕,然后洗滌、去除脫落的細胞。然后將細胞按照上述1.4分組處理細胞,并在光學顯微鏡下于0、24h拍照。通過監測劃痕寬度確定細胞遷移率。

1.9Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲實驗:對于遷移測定,將A549細胞(5×104的細胞密度)混合在100μL的無血清培養基中,并接種到上室中;將600μL含5% FBS培養基接種在下室中。而侵襲測定中,上室首先用Matrigel溶膠在37℃、5% CO2的培養箱中涂抹,使其凝固。然后將細胞接種到上室中,并將完全培養基添加到下室中。遷移、侵襲測定實驗均在培養箱中培養48h后,用棉簽去除上室細胞,將下室細胞于4%多聚甲醛中室溫固定30min,并用1%結晶紫染色液染色過夜,通過計數染色細胞定量細胞遷移、侵襲數目。

1.10Western blot檢測相關蛋白表達水平:使用含有蛋白酶的細胞裂解物洗滌細胞并在冰上裂解。每個樣品的蛋白質濃度由BCA蛋白質測定試劑盒確定。在10% SDS-PAGE上分離蛋白質樣品并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,用相應的抗體對膜進行印跡,并使用ECL蛋白質印跡檢測試劑在Tanon成像系統上進行可視化蛋白,以GAPDH為內參,采用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量,其中一抗分別為1∶1000 OPN、1∶1000 FAK、1∶2000 GAPDH。

2 結 果

2.1四種肺癌細胞系及BEAS-2B細胞中OPN、FAK mRNA表達水平:四種肺癌細胞系(H596、H520、A549、H1703)中OPN、FAK mRNA表達水平較BEAS-2B細胞均顯著增加(P<0.05),其中以A549細胞中OPN、FAK mRNA表達水平的變化最為顯著,因此用于后續研究,見表2。

表2 細胞中OPN FAK mRNA表達水平比較

2.2比較各組A549細胞中增殖率的變化:與對照組相比,GS-L組、GS-M組、GS-H組A549細胞增殖率顯著降低,rOPN組顯著增加(P<0.05);與GS-H組相比,GS-H+rOPN組A549細胞增殖率顯著增加(P<0.05),與rOPN組相比,GS-H+rOPN組A549細胞增殖率顯著降低(P<0.05),見表3。

表3 A549細胞中增殖率變化

2.3比較各組A549細胞中凋亡率的變化:與對照組相比,GS-L組、GS-M組、GS-H組A549細胞凋亡率顯著增加,rOPN組顯著降低(P<0.05);與GS-H組相比,GS-H+rOPN組A549細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),與rOPN組相比,GS-H+rOPN組A549細胞凋亡率顯著增加(P<0.05),見表4、圖1。

圖1 觀察A549細胞凋亡變化

表4 A549細胞中增殖率變化

2.4比較各組A549細胞中OPN、FAK mRNA的表達水平:與對照組相比,GS-L組、GS-M組、GS-H組A549細胞OPN、FAK mRNA表達水平顯著降低,rOPN組顯著增加(P<0.05);與GS-H組相比,GS-H+rOPN組A549細胞OPN、FAK mRNA表達水平顯著增加(P<0.05),與rOPN組相比,GS-H+rOPN組A549細胞OPN、FAK mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),見表5。

表5 A549細胞中OPN FAK mRNA表達水平比較

2.5比較各組A549細胞中的遷移率變化:與對照組相比,GS-L組、GS-M組、GS-H組A549細胞遷移率顯著降低,rOPN組顯著增加(P<0.05);與GS-H組相比,GS-H+rOPN組A549細胞遷移率顯著增加(P<0.05),與rOPN組相比,GS-H+rOPN組A549細胞遷移率顯著降低(P<0.05),見圖2、表6。

圖2 劃痕實驗檢測遷移率變化

表6 A549細胞中遷移率的比較

2.6比較各組A549細胞中的遷移、侵襲數變化:GS-L組、GS-M組、GS-H組侵襲、遷移數較對照組顯著降低(P<0.05);rOPN組侵襲、遷移數較對照組顯著增加(P<0.05);GS-H+rOPN組侵襲、遷移數較GS-H組顯著增加,但較rOPN組顯著降低(P<0.05),見圖3、表7。

圖3 A549細胞侵襲、遷移變化

表7 A549細胞中侵襲遷移細胞數的比較

2.7比較各組A549細胞中OPN/FAK信號通路蛋白表達:GS-L組、GS-M組、GS-H組OPN、p-FAK/FAK較對照組顯著降低(P<0.05);rOPN組OPN、p-FAK/FAK較對照組顯著增加;GS-H+rOPN組OPN、p-FAK/FAK較GS-H組顯著增加,但較rOPN組顯著降低(P<0.05),見圖4、表8。

圖4 A549細胞中OPN、p-FAK、FAK表達(Western blot圖)

表8 A549細胞中OPN p-FAK/FAK比較

3 討 論

肺癌是癌癥死亡的最常見原因,盡管對NSCLC的治療方法層出不窮,但肺癌患者的預后在過去幾年中并未發生顯著變化[9]。因此正確理解參與癌癥發病機制的細胞信號通路,對于尋求有效藥物改善NSCLC治療效果至關重要。

GS屬于類黃酮家族,是一種天然存在的、來自豆類的植物雌激素,具有與哺乳動物雌激素相似的化學結構,可以預防骨質疏松癥、降低心血管疾病發病風險、緩解絕經后癥狀,抑制炎癥反應。除此之外,GS還具有廣泛的抗癌特性如在卵巢癌研究中[10],提供抑制促炎生物標志物水平發揮抗癌作用,成為治療卵巢癌的潛在候選藥物?；谝陨衔墨I報道,本研究猜測GS在NSCLC發展中也可能具有抗癌作用。研究結果表明GS可以抑制A549細胞增殖、遷移及侵襲,誘導其凋亡,呈現濃度依賴性,與Yu等[11]研究結果相吻合,表明GS可抑制A549細胞的惡性行為,表現出抗癌作用。

據報道OPN是一種分泌性細胞外基質糖基化磷蛋白,參與骨重塑中的骨基質礦化和重吸收過程,OPN高表達與幾種腫瘤類型的癌癥進展均有關,包括乳腺癌、肝癌、卵巢癌和結直腸癌[12]。推測肺癌的發生可能也與OPN過表達有關,本研究結果顯示,四種NSCLC細胞系(H596、H520、A549、H1703)中OPN、FAK mRNA表達水平較BEAS-2B細胞均顯著增加,表明NSCLC發生可能與OPN、FAK過表達有關。進一步的相關研究表明OPN在NSCLC中上調,且在NSCLC轉移中發揮作用[13];在NSCLC-A549細胞研究中,OPN可抑制FAK磷酸化水平,可顯著抑制OPN誘導的細胞侵襲[14]。但經不同濃度的GS處理A549細胞后,OPN、FAK基因和蛋白表達水平顯著下調,猜想GS可以抑制OPN/FAK信號通路進而阻止A549細胞增殖、遷移和侵襲,誘導其凋亡。為驗證上述猜想,實驗引入OPN激活劑-rOPN進行回復驗證,結果發現rOPN逆轉了GS-H對A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用,表明GS通過抑制OPN/FAK信號通路降低A549細胞的遷移、侵襲及增殖能力,促進其凋亡。

綜上所述,GS可以促進NSCLC-A549細胞凋亡,抑制其增殖、遷移和侵襲,可能與抑制OPN/FAK信號通路有關,為NSCLC治療提供潛在藥物。