植物中角鯊烯環氧酶的研究進展

宓雅琪,高龍龍,2,宋澤,高海云,趙歡△（.首都醫科大學中醫藥學院,北京 00069;2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所,北京 009;.中國中醫科學院中醫藥健康產業研究所,江西 德興 4200）

1 引言

角鯊烯環氧酶（[EC1.14.99.1]squalene epoxidase，SQE）屬于A類的黃素蛋白單加氧酶，廣泛存在于動物、真菌、植物等真核生物中，可催化角鯊烯的碳-碳雙鍵發生環氧化反應，生成2,3-環氧角鯊烯（2,3-oxidosqualene，OS）。SQE發揮催化功能一般需要黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等輔因子的參與[1]，且依賴NADPH-細胞色素P450還原酶（NADPH-cytochrome P450 reducatse，CPR）[2]將環氧基團引入到角鯊烯的碳-碳雙鍵中[3]，黃素被還原后NADP+立即釋放（見圖1）。SQE是甾醇和三萜生物合成中第一個引入氧的酶，是第一個需要外援電子輸入的酶，也是途徑中繼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）之后第二個重要的限速酶。

諾貝爾獎獲得者Corey E.J在1966年首次發現OS是角鯊烯到羊毛甾醇轉化的必需中間體，推翻了此前“氧化和環化同步進行不經過中間體”的假說[4]。對催化這一氧化步驟的SQE最早的報道來自于哈佛大學的S Yamamoto[5]等研究者，早在1970年其將從兔肝臟中提取的微粒體與角鯊烯一起孵育，發現加熱處理后環氧角鯊烯環化酶的活性喪失，然而角鯊烯轉化為環氧角鯊烯的酶活力并沒有減弱。日本的T Ono[6-7]等研究者證實角鯊烯環氧酶系統包括兩個部分，即末端氧化酶SQE和黃素蛋白CPR，且首次從兔肝微粒體中純化得到SQE并確定了其在體外的活性測定方法。第一個SQE基因（ERG1）則由A Jandrositz[8]等人通過構建酵母突變體庫克隆得到，隨后Landl[9]等人利用基因敲除技術獲得的erg1缺失的釀酒酵母突變株成為了后續驗證異源SQE基因功能的主要表達系統之一。Nagumo[10]等人通過去除兔源SQE的N末端99個氨基酸后在大腸桿菌（Escherichia coli）中首次得到有活性的重組蛋白，值得注意的是動物中SQE需要S105 fraction激活。1992年就有了關于從豬肝中純化出來的SQE在pH7.4時能夠將一半的OS轉化為2,3;22,23-雙環氧角鯊烯（2,3;22,23-dioxidosqualene，DOS）的報道[11]，多個物種體內也檢測到了在氧化鯊烯環化酶（oxidosqualene cyclase，OSC）抑制劑下能夠同時積累OS和DOS。雖然同屬于單加氧酶系，但是與細胞色素P450單加氧酶不同的是，SQE依賴于FAD，無heme結構域，不受P450抑制劑的調控。直到2002年Suzuki H[12]等人首次從植物中克隆到2個SQE基因，并在erg1缺失的酵母突變株K1N1中驗證功能。由于SQE在不同物種中具有序列和功能的保守性，植物中SQE基因多年來受關注度低，導致其研究起步較晚，截至目前，雖然文獻報道了多個植物來源的SQE基因信息，但是明確功能的并不多（見表1），深入開展研究的更是少之又少。然而，SQE在抑制劑、拷貝數、表達量以及酶系統組成等諸多方面存在物種的差異，提示了SQE在植物甾醇和三萜等生物合成途徑中的重要作用有待深入挖掘，引發科研人員對植物SQE的關注和深入思考。本文對植物SQE基因的分子克隆、功能驗證、基因表達調控等方面進行綜述，并提出未來研究的新思路，為其進一步的研究和開發利用提供依據。

表1 不同物種來源的SQE基因信息匯總表

2 SQE基因的克隆、鑒定與活性驗證

2.1 植物中SQE基因克隆研究 基于酵母和哺乳動物SQE基因序列相似性，使得植物SQE基因變得相對容易。如1994年，擬南芥中的一段表達序列標簽[13]被發現為ERG1同源序列，隨后被命名為Sqp2；Ar.tha。1999年Sch?fer[14]等人用Sqp2；Ar.tha為分子探針，在甘藍型油菜中發現了兩條SQE基因。此后，包括擬南芥及多種藥用植物中的SQE基因[12,15-18]陸續得以克隆，為后續的功能驗證等研究奠定了基礎（見表1）。

2.2 SQE基因的功能驗證研究 植物SQE基因功能研究始于蒺藜苜蓿，2個MtSQEs可以回補酵母K1N1中erg1的缺失，但N末端是否截斷不影響其活性[12]。研究人員曾在大腸桿菌中表達不同植物SQE，多數表達為包涵體形式[22,27,29,39]，僅有絞股藍來源的SQE純化后可在體外復性[22]。Manzoor[21]等人成功在煙草中對甘草GgSQE1進行瞬時和穩定表達，驗證其具有鯊烯環氧酶活性。Unland K[20]等人結合酵母回補實驗、煙草中亞細胞定位以及橡膠草RNA干擾技術等手段較為系統地驗證了橡膠草SQE的功能。

3 SQE基因的表達模式和蛋白定位研究

真菌和哺乳動物中SQE基因常為單拷貝，而植物中SQE基因往往有多個拷貝，且呈現不同的表達模式。例如，擬南芥[16]中AtSQE1和AtSQE3廣泛表達，而AtSQE2和AtSQE4只最低豐度地表達，甚至在葉和種子中都未能檢測到AtSQE2。人參[30]中PgSQE1幾乎在所有器官中都豐富地分布，而PgSQE2只在葉柄和花蕾中較高表達。催眠睡茄[39]、白樺[24]、甘藍型油菜[14,31,40]等物種的SQEs在葉子中表達水平最高，三七[17]、滇重樓[32]、雷公藤[27]、遠志[33]等物種的SQEs在根中表達最高。黃芪[34]、澤瀉[35]、羅漢果[29]、橡膠草[20]等植物中SQE均表現出明顯的植物組織特異性。在植物生長發育的不同時期SQE基因亦表現出明顯的差異表達。擬南芥SQE1基因[14]在種子發育早期缺失，但在中后期可以檢測到；羅漢果中兩個SQE基因都主要在果實中積累，但SgSQE1快速增長并在第15天達到最高水平，SgSQE2則在此期間內表達水平相對穩定。以上研究提示我們，植物中多拷貝的SQE基因參與不同的生物合成途徑，很可能與特定的甾醇或三萜成分積累直接相關。

據報道，酵母SQE具有內質網和脂滴的雙定位[41]。多種植物SQE的亞細胞定位顯示位于內質網膜上[1]，研究人員分別在橡膠草TkSQE1的N端或C端與藍色熒光蛋白Cerulean融合注射本氏煙草，觀察到TkSQE1-Cerulean（C端）位于內質網膜上，而N端融合蛋白卻未觀察到熒光[20]，表明SQE與熒光蛋白在N端和C端融合方式可能影響蛋白的狀態。此外，紫花苜蓿MsSQE1在洋蔥表皮細胞中瞬時表達，由于試驗方法的局限不能觀察到細胞器的結構，僅在細胞膜上觀察到微弱熒光[36]。

4 激發子對SQE基因表達的影響

植物免疫反應激發子（elicitor）是一類可以誘導植物發生免疫防御反應的化合物，按照來源可分為外源性激發子和內源性激發子[42]。大量研究表明，激發子可以誘導SQE基因及三萜和甾醇生物合成途徑相關基因的表達，進而促進三萜和植物甾醇類活性產物的合成與積累（見表2）。

表2 影響植物SQE基因表達的激發子和轉錄因子匯總表

4.1 外源性激發子對SQE基因表達的影響 外源性激發子主要來源于對植物產生危害的微生物和昆蟲等[43]，目前用于誘導三萜及植物甾醇類產物合成的主要為真菌類激發子。研究表明，黑曲霉菌（Aspergillus niger）可顯著上調甘草[44]SQE基因的表達，與參與植物防御反應的一氧化氮、水楊酸、茉莉酸等信號分子有關。黑曲霉菌與熱帶念珠菌（Candida tropicalis）單獨或混合使用[45]均可顯著上調西洋參不定根中SQE基因的表達，促進人參皂苷的合成。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）可誘導西洋參[46]、滇重樓[47]中SQE基因的表達，促進人參皂苷和重樓皂苷的合成。幾丁質脫乙酰化后的殼聚糖可誘導人參細胞的SQE基因表達[48]，通過激活MAPK通路增加人參皂苷的積累。此外，乙烯利、二環己基碳二亞胺和石決明可分別增強白樺[24]、人參懸浮培養細胞[49]和高麗參[50]中SQE基因表達。

4.2 內源性激發子對SQE基因表達的影響 內源性激發子來源于植物自身，目前用于誘導三萜和植物甾醇類活性產物合成的主要為茉莉酸酯類成分，如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和2-羥乙基-茉莉酸酯（2-hydroxyethyl jasmonate，HEJ）、二氫茉莉酸甲酯（methyl dihydrojasmonate，MDJ）等。

研究表明，一定劑量的MeJA可誘導植物SQE基因的表達，隨之三萜和植物甾醇含量有所增加，如澤瀉[35]、白樺[24]和人參[30]等。HEJ可誘導三七[17]SQE基因的表達，增加人參皂苷的合成，MDJ和JA共同作用[51]可誘導三七不定根中SQE等基因的表達，促進多種皂苷成分積累，并出現6種新產物。此外，脫落酸、赤霉素[21]亦被證明可上調甘草GgSQE1的表達。水楊酸可誘導栽培黑種草[19]SQE基因的表達。纖維素酶降解的人參懸浮細胞細胞壁[52]和低半乳糖醛酸通過不同作用機制上調人參懸浮培養細胞SQE基因表達[53-54]。

然而，內源性激發子并非對所有SQE基因的表達都具有促進作用。MeJA處理蒺藜苜蓿后MtSQE2基因的表達水平顯著提高，而MtSQE1基因無明顯變化[12]。MeJA能夠上調雷公藤中TwSQE1-TwSQE4的表達水平[27]，卻對TwSQE5無效。人參根受MeJA處理后PgSQE1水平上調，PgSQE2反而受到抑制。總之，內源性誘導子對SQE基因表達的影響包括促進、抑制以及無明顯影響三種，暗示同一植物不同SQE基因拷貝參與了不同的生源途徑，執行不同的生物學功能。

5 轉錄因子對SQE基因表達的影響

植物在長期進化過程中，形成了復雜的分子信號網絡，從而能夠迅速地感知外界環境并調控基因的表達，以適應、抵抗和耐受各種生物和非生物的脅迫。順式作用元件一般位于基因的啟動子中，使用染色體步移技術可得到SQE基因的啟動子。如從催眠睡茄[39]、白樺[24]等植物中分別獲得513bp、1193bp的SQE基因啟動子序列，從中發現了多個與植物激素、生物和非生物脅迫相關的關鍵順式作用元件。轉錄因子（transcription factor，TF）與真核基因的順式作用元件發生特異性相互作用，可調控基因的轉錄。目前發現植物中與SQE基因相關的轉錄因子多來自于bZIP、WRKY和MYB家族。

天門冬中的bZIP家族轉錄因子ArTGA1和ArTGA2與SQE基因啟動子上的MeJA反應性順式作用元件結合可調節其表達水平[37]。人參[55]中PgWRKY4X可與PgSE啟動子W-box序列結合，其過表達可上調PgSE等基因的表達，進而增加人參皂苷的合成。催眠睡茄中WsWRKY1與SS和SQE基因的啟動子W-box序列結合，促進甾體類物質醉茄素A的積累，可作為有效工具來增加甾醇和三萜合成、增強植物的防御反應[28]。樺樹[56]中鑒定到2個轉錄因子，其中BpMYB21上調SQE基因的表達，BpMYB61則下調SQE基因的表達，表明BpMYB61可能為一種抑制性的轉錄因子。

6 SQEs酶的結構

植物中SQE基因一般編碼500-600個氨基酸[29,57-58]，相對分子質量約為55-70kDa，等電點大約為7.5-9，多為疏水性蛋白，其二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主[57]。不同植物SQE的N末端同源性較低，如三七PnSE1和PnSE2的N末端70個氨基酸僅有20.7%的序列一致性[57]。從西葫蘆[26]中鑒定出的3個CpSEs均具有鯊烯環氧酶活性，且其中CpSE2的活性最強，CpSE1和CpSE3活性稍弱。植物中SQE大多具有1個及以上跨膜域[29,57-58]，因此可能導致在原核系統中表達出沒有活性的包涵體。近些年，人類SQE作為降膽固醇和癌癥的潛在靶點越來越受重視，2019年Andrew J Brown[59]等人報告了期待已久的人類SQE結構，解析了其催化結構域的晶體結構及其與兩種抑制劑的配合物，并對人類SQE催化生成DOS的機制進行闡釋。首個SQE結構的解析一方面為與人類健康和疾病密切相關的SQE研究提供更具說服力的證據，另一方面為植物中SQE的挖掘提供借鑒。

7 總結

由于SQE基因在動物膽固醇、真菌甾醇合成途徑中的重要作用，有關SQE基因的研究層出不窮，主要作為烯丙胺類新型降低膽固醇藥物[60]、腫瘤治療[61]、抗真菌藥物[62]的靶點。一般而言，鯊烯環氧酶可催化角鯊烯環氧化生成OS，但目前在大鼠、豬、酵母、紅芒柄花[25]、西葫蘆、樹莓中均曾檢測到DOS的存在。然而，角鯊烯轉化為雙環氧角鯊烯的具體反應機理，雙環氧角鯊烯在植物體內存在的生物意義及其下游產物在植物中發揮的功能均有待進一步的研究。一般而言，植物SQE通常優先使用OS，但有意思的是，葉敏團隊發現與野生型相比，突變體AtLUP1T729F和SAD1S728F優先用DOS而不是OS。關鍵堿基改變引發底物順序優先級的改變提示我們，基因突變或許也可以使角鯊烯在其他成鍵部位進行環氧化，這可能是一個值得深入研究的方向。

植物SQE酶不僅在催化功能、參與的生物合成途徑等方面上存在差異，而且可與途徑上其他酶甚至某一中間體發生相互作用影響催化效率。有關植物中SQE基因研究的根本目的是增加下游三萜或甾醇產物的產量。目前，研究的主要方向是通過上調植物或工程菌中SQE基因的表達水平來促進三萜或甾醇合成，少有關注提升SQE酶活性的研究，本文認為調節SQE酶活性、酶之間相互作用亦是有潛力的研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突