TNF-α和FOXA2蛋白在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

黃夢盼，王學紅，蘆永福，

（1．青海大學研究生院，青海 西寧 810016；2．青海大學附屬醫院消化內科，青海 西寧 810012）

結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是一種涉及遺傳、環境和不良生活方式相互作用的多因素疾病。結直腸癌早期接受治療的患者其5 年生存率可高達90%，晚期患者5 年生存率僅為12%，且預后仍然較差[1]。因此，篩查早期結直腸癌是降低其發病率和死亡率的關鍵策略之一。結直腸腺瘤-癌序列一直被認為是結直腸癌的主要發生途徑，腺瘤從上皮增生發展而來，最初包含低級別異型增生，然后發展為高級別異型增生，隨后發展為浸潤性癌，這一過程可能需要10～15年[2]，從腺瘤到癌的長時間發展為CRC篩查提供了依據。慢性炎癥通常是腫瘤發展所必需的[3]，炎癥環境促進細胞增殖，削弱血管屏障，促進免疫細胞侵襲和遷移。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是一種同源三聚體蛋白，由活化的巨噬細胞及其他多種腫瘤細胞產生，巨噬細胞和腫瘤細胞分泌的TNF-α蛋白均可通過自分泌方式調節，從而加速腫瘤的進展。Obeed 等[4]發現TNF-α mRNA 在結直腸癌腫瘤組織中的相對表達水平顯著高于鄰近正常組織，此外，與早期CRC 患者相比，晚期CRC 患者組織中TNF-α mRNA 的表達顯著升高。叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，FOXA2）是叉頭框轉錄因子家族成員之一，包含兩個轉錄激活域和一個叉頭域，以DNA結合“翼狀螺旋結構域”為特征。目前，關于TNF-α、FOXA2蛋白二者聯合在結直腸癌變過程中表達及作用的研究較少。本研究將聯合檢測TNF-α、FOXA2蛋白在不同結直腸組織中的表達，分析這兩個蛋白在結直腸癌的發生、發展及癌變中各自揮發的作用及相互關系，為結直腸癌的早期發現、臨床診斷和治療提供新思路及初步理論支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2021年12月—2022年6月由青海大學附屬醫院首次確診為結直腸癌，并在該院行手術治療且病例資料完整的患者39 例，其中男性23 例，女性16 例，取CRC 組織及配對癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣5 cm以上，經病理證實為非腫瘤的組織）。病理類型均為結直腸腺癌，男性23 例，女性16 例，低分化腺癌16例，中-高分化腺癌23例；浸潤深度未侵及漿膜層13例，漿膜層及以外26 例；無淋巴結轉移19 例，有淋巴結轉移20 例；臨床分期I～II 期17 例，III～IV 期22例；臨床分期標準參照國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合會制定的TNM 分期標準（第8 版）。選取同期結直腸腺瘤患者42 例，其中男性23 例，女性19 例；每位患者均采用腸鏡切除結直腸腺瘤組織，經病理證實后用活檢鉗取2 塊組織用于本研究。其中腺瘤直徑＜1 cm 的28例，腺瘤直徑≥1 cm 的14 例；管狀腺瘤23 例，絨毛狀腺瘤19例；無蒂腺瘤25例，有蒂腺瘤17例。

1.2 納入與排除標準

本研究的病例納入標準為：①所有研究對象均經病理學檢查確診為結直腸腺瘤或結直腸癌患者；②檢測前均為原發性腫瘤，均未接受化療、放療及免疫等治療；③患者愿意進入該項研究，并簽署知情同意書。

排除標準為：①既往有其他系統腫瘤手術史者；②合并家族遺傳性息肉病、炎癥性腸病、血液系統疾病及自身免疫性疾病病史者；③嚴重感染，重要器官功能障礙，1 個月內服用激素類、免疫抑制劑、非甾體抗炎藥者；④有結腸鏡檢查禁忌證者。

本研究已通過青海大學附屬醫院倫理委員會審批，審批編號SL-2019058。

1.3 試劑和儀器

一抗TNF-α 多克隆抗體購自Abbkine 公司，FOXA2抗體購自博士德公司，二抗HRP標記的山羊抗兔IgG購自Servicebio公司。

1.4 免疫組織化學染色

根據預實驗結果，按1∶200 稀釋配制TNF-α、FOXA2抗體。按說明書操作，所取組織標本均放入固定液中固定，經石蠟包埋后切片，脫蠟后經過梯度乙醇進行水化。將切片浸于修復液中加熱進行抗原修復，等待液體溫度冷卻至室溫后，放于PBS 緩沖液中浸泡，隨后取出，用干凈紗布擦拭去除多余液體，在切片組織上加入內源性過氧化物酶阻斷劑。水洗后分別滴入一抗（TNF-α、FOXA2 抗體）孵育過夜，再滴加二抗，經DAB 顯色，分化液分化后返藍，脫水透明，待切片晾干后封片，顯微鏡下讀片判讀。

1.5 免疫組化染色結果判讀

TNF-α、FOXA2蛋白免疫組化陽性產物呈棕黃色或棕褐色，主要位于細胞質、細胞核內。結果由2 名有經驗的病理科醫師雙盲判讀，采用半定量綜合計分方法：高倍鏡下隨機選取4 個視野，根據染色陽性強度及陽性面積劃分等級。陽性強度：基本無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性面積：≤10%為0 分，＞10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%為3 分。染色總分為強度評分與陽性面積評分之積，≤3分視為陰性，≥4分視為陽性。

1.6 統計分析

本實驗選擇SPSS 25.0 進行數據的統計和分析。計數資料統計描述采用率來表示，分析TNF-α和FOXA2蛋白表達與結直腸腺瘤、結直腸癌患者臨床病理指標的關系采用卡方檢驗或校正卡方檢驗；TNF-α和FOXA2蛋白在結直腸癌中的表達水平相關性研究采用Spearman秩相關。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TNF-α蛋白在不同結直腸組織中的表達

TNF-α蛋白在結直腸3 種不同組織中的免疫組化染色觀察結果見圖1，陽性表達率統計分析見表1。TNF-α蛋白在癌旁正常結直腸黏膜、結直腸腺瘤及CRC 組織中的陽性表達率分別為23.08%、50.00%和76.92%，癌旁正常結直腸黏膜組織中TNF-α蛋白表達最低，結直腸腺瘤和CRC組織與之相比，差異均有統計學意義（P＜0.05 或0.01），且結直腸癌組織中TNF-α蛋白陽性表達率顯著高于結直腸腺瘤組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 TNF-α蛋白在3種不同結直腸組織中陽性表達率的比較

圖1 TNF-α蛋白在不同結直腸組織中的表達

2.2 TNF-α蛋白表達與患者臨床病理指標的關系

2.2.1 TNF-α蛋白表達與結直腸腺瘤組臨床病理指標的關系免疫組化分析結果見表2，不同腺瘤直徑大小及組織學類型患者TNF-α蛋白表達陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腺瘤數目、腺瘤形狀患者TNF-α蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 TNF-α蛋白表達與結直腸腺瘤患者臨床病理指標的關系

2.2.2 TNF-α蛋白表達與結直腸癌組臨床病理指標的關系免疫組化分析結果見表3，TNF-α蛋白表達在不同分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期的結直腸癌組織間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；TNF-α表達在不同年齡、性別、腫瘤直徑、部位及有無脈管神經侵犯的結直腸癌組織間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 TNF-α蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理指標的關系

2.3 FOXA2蛋白在不同結直腸組織中的表達

FOXA2 蛋白在結直腸3 種不同組織中的免疫組化染色觀察結果見圖2，陽性表達率統計分析見表4。FOXA2 蛋白在癌旁正常結直腸黏膜、結直腸腺瘤及CRC 組織中的陽性表達率分別為23.08%、52.38%和79.49%；癌旁正常結直腸黏膜組織中FOXA2蛋白表達最低，結直腸腺瘤和CRC組織與之相比，差異均有統計學意義（P＜0.01）；且結直腸癌組織中FOXA2 蛋白陽性表達率顯著高于結直腸腺瘤組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 FOXA2蛋白在3種不同結直腸組織中的陽性表達率比較

圖2 FOXA2蛋白在不同結直腸組織中的表達

2.4 FOXA2蛋白表達與患者臨床病理指標的關系

2.4.1 FOXA2 蛋白表達與結直腸腺瘤組臨床病理指標的關系免疫組化分析結果見表5，不同腺瘤直徑大小及形狀類型患者FOXA2 蛋白表達陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腺瘤數目、組織學類型患者FOXA2蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4.2 FOXA2 蛋白表達與結直腸癌組臨床病理指標的關系免疫組化分析結果見表6，FOXA2 蛋白表達不同分化程度、淋巴結轉移和TNM分期的結直腸癌組織間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；FOXA2 蛋白表達在不同年齡、性別、腫瘤直徑、部位、浸潤深度及有無脈管神經侵犯的結直腸癌組織間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表6 FOXA2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理指標的關系

2.5 結直腸癌組織中TNF-α和FOXA2表達相關性

Spearman秩相關分析表明，TNF-α和FOXA2在結直腸癌組織中的表達呈正相關（rs=0.475，P＜0.05），見表7。

表7 結直腸癌組織中TNF-α與FOXA2蛋白表達水平的相關性

3 討 論

近年來，隨著生活方式的改變、人口老齡化的加速和飲食結構的轉變，中國CRC約占全球所有新增病例的30%[5]。雖然結直腸癌發病率呈上升趨勢，但我們觀察到結直腸癌死亡率略有下降[6]。這種減少可能至少涉及兩個方面：首先，CRC篩查項目在早期階段發現癌癥已經在人群中證明了其有效性；二是結直腸癌患者的臨床治療和管理水平大幅提高。因此，通過預防性切除結直腸癌的癌前病變可使結直腸癌的發病率和死亡率顯著降低。

TNF-α由19 種蛋白質組成，具有多種生物學功能，為細胞激活、分化、增殖、凋亡提供信號，還能調節多個組織和器官的免疫和炎癥反應。本實驗結果表明，TNF-α蛋白在結直腸腺瘤組及結直腸癌組的陽性率均顯著高于癌旁正常結直腸黏膜組，且CRC組的陽性率高于結直腸腺瘤組。于秀冰等[7]檢測120例CRC及癌旁組織中的TNF-α蛋白表達，結果發現CRC組織中TNF-α陽性表達率為71.67%，癌旁組織中TNF-α蛋白陽性表達率僅為26.67%，兩者具有顯著的統計學差異。本研究結果與其基本一致，隨著病情的進展，TNF-α蛋白水平呈現進行性升高的趨勢，提示其表達高低與結直腸癌變過程相互關聯。本實驗發現TNF-α蛋白陽性表達率與結直腸腺瘤病理組織分型相關，絨毛狀腺瘤TNF-α蛋白陽性率顯著高于管狀腺瘤。研究表明[8]，絨毛結構成分占比越高，腺瘤惡性轉化率越高，絨毛狀腺瘤的癌變率較管狀腺瘤明顯升高[9]。TNF-α蛋白在直徑＜1 cm 腺瘤中的陽性表達率顯著低于直徑≥1 cm的腺瘤，Lieberman等[10]發現，腺瘤的大小與發生浸潤性癌的風險程度成正比，隨著腺瘤大小的增加，≥1 cm 的腺瘤癌變率高達30.6%，而小腺瘤（6～9 mm）患者處于中等風險，癌變率為6.6%，提示隨著腺瘤癌變風險增加，TNF-α蛋白在結直腸腺瘤中的表達增高。本研究結果發現，TNF-α蛋白表達陽性率較高，腫瘤的分化程度越差，浸潤深度越深，淋巴結轉移率越高，TNM分期越晚，這對判斷CRC預后具有重要意義。本研究與龍華婧等[11]研究結果基本一致，其研究還表明TNF-α蛋白在CRC遠處轉移患者中的表達較未轉移患者明顯升高，TNF-α蛋白表達情況對判斷是否發生遠處轉移具有重要意義。Stanilov等[12]發現TNF-α蛋白在CRC 患者血清中表達明顯升高，并且TNF-α蛋白表達水平與腫瘤臨床分期、分化程度呈正相關，生存分析提示血清TNF-α水平高的CRC患者的生存率明顯低于TNF-α蛋白水平低的患者。TNF-α蛋白表達水平升高可能是一個獨立的預后指標，可用于隨訪結直腸癌患者。

FOXA2蛋白促進腫瘤的發生、發展主要與TNF-α作用有關。Liu等[13]研究發現，IKK-α是TNF-α下游的重要激酶，在S107/S111 位點與FOXA2 相互作用并發生磷酸化，使其NUMB 蛋白表達下調，一系列過程使Notch 通路激活。Notch 信號通路在正常腸上皮的自我更新和穩態以及結直腸癌進展中至關重要，通路中的轉錄因子的過表達與CRC進展和轉移相關。因此，通過TNF-α/IKK-α/FOXA2/NUMB/NOTCH1 通 路， 將TNF-α和FOXA2聯系起來，為揭示腫瘤生長的分子基礎和確定癌癥治療的潛在靶點提供了一個新起點。

叉頭盒蛋白A2（FOXA2），是一種先鋒轉錄因子，是維持各種細胞和組織正常功能的關鍵調節因子。多項研究通過激活不同通路證實FOXA2 蛋白與胃癌[14]、肺癌[15]、卵巢癌[16]、胰腺癌[17]等癌癥的發生、發展有關。彭好[18]研究發現FOXA2 蛋白在正常結直腸黏膜組、增生性息肉組、腺瘤性息肉組、CRC組的陽性表達 率 為13.3%（6/45）、31.1%（14/45）、62.2%（84/135）、86.7%（39/45），且兩兩之間表達水平的差異有統計學意義，因此可以推斷FOXA2蛋白對結直腸癌及癌前病變有一定的診斷價值。本研究結果與其基本一致，發現FOXA2蛋白在結直腸腺瘤及結直腸癌中高表達，而在癌旁正常結直腸黏膜組織中呈低表達，提示FOXA2蛋白在結直腸正常黏膜→結直腸腺瘤→結直腸癌的發生、發展過程中起了促進作用。本實驗發現，FOXA2蛋白表達在腺瘤的大小和形狀方面有統計學差異。與內鏡下表現為扁平狀或廣基無蒂的病變相比，帶蒂腺瘤發生率更高，但癌變的風險較低[19]，提示隨著腺瘤癌變風險增加，FOXA2蛋白在結直腸腺瘤中的表達增高。本研究結果發現，FOXA2 蛋白陽性表達率越高，腫瘤的分化程度越差，淋巴結轉移率越高，TNM分期越晚。本實驗與既往多項研究報道相一致。Wang等[20]通過實時熒光定量PCR法檢測FOXA2蛋白在結直腸癌組織中的表達水平，發現FOXA2 蛋白在CRC 組織中的表達明顯高于正常結直腸組織，且高表達的FOXA2蛋白與CRC的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等顯著相關。FOXA2蛋白在CRC癌變過程中發揮著重要作用，但其機制還不十分清楚，可能與FOXA2蛋白表達促進結直腸癌上皮-間質轉化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）有關。EMT 是指細胞失去極性并破壞細胞間連接[21]，上皮細胞轉變為可移動的間充質細胞，間質細胞的細胞間黏附能力降低，遷移能力增強，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的減少和波形蛋白（vimentin）的增加可以被認為是EMT 發生的標志[22]。作為一種癌基因，FOXA2蛋白可能增強結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。Wang 等[20]通過體外和體內實驗表明，下調FOXA2 蛋白的表達，可以抑制結直腸癌細胞系HCT116和HT29細胞G1期向S期的轉變，降低體外結腸癌細胞的增殖。同時，腫瘤組織中E-cadherin 表達上調，vimentin 表達下調，提示EMT 被抑制。EMT 可能是FOXA2蛋白促進結腸癌轉移的關鍵因素。

本研究分析TNF-α和FOXA2 蛋白兩者在CRC 組織之間表達的相關性，結果顯示：在結直腸癌組織中TNF-α與FOXA2蛋白的表達呈正相關，說明二者在結直腸癌發生、發展過程中的作用是相互協同的。當結直腸腺瘤患者組織中TNF-α、FOXA2蛋白表達為強陽性時，癌變的可能性大，應引起足夠的重視，需要定期復查、密切監控。目前對于TNF-α和FOXA2蛋白參與腺瘤發生及癌變的機制還尚不明確，本研究選取樣本量相對較少、入組患者的來源地域較單一局限，仍然需要多中心、多地區、多人群的研究及更多的實驗進一步深入探索結直腸癌變過程的發生機制。