采用體外微核試驗(yàn)檢測某電子煙液的遺傳毒性

杜秀明，張麗婷，徐靈芝

（1．上海化工院檢測有限公司，上海 200062；2．上海化工研究院有限公司，上海 200062）

電子煙液又名電子煙油，是配合電子煙使用的電子霧化液。電子煙液通過電子煙霧化器加熱，能夠產(chǎn)生如香煙一樣的霧氣，使人吸入劑量不等的尼古丁而獲得類似于抽吸傳統(tǒng)卷煙的生理感受。電子煙液的主要成分是食用級或者醫(yī)藥級別的丙三醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇、煙草專用香精，以及一定含量的煙堿（尼古丁）成分[1-2]。尼古丁，是一種無色至淡黃色透明油狀液體，是煙草中含氮生物堿的主要成分，其具有成癮性和毒性。有相關(guān)報(bào)道，成人一次吸食6.5～13 mg/kg就可能致死[3]。

國內(nèi)針對電子煙的研究報(bào)道多集中在電子煙組分的分析方法、理化指標(biāo)的測定等領(lǐng)域[4-6]，國外針對電子煙的研究報(bào)道多集中在尼古丁成癮性及吸食安全性方面的研究[7]。Misra等[8]比較了電子煙液和氣溶膠提取物的細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)性、基因毒性。Gao等[9]對傳統(tǒng)卷煙、無煙氣煙草產(chǎn)品、電子煙、尼古丁進(jìn)行了DNA損傷評價(jià)。2016年，美國食品和藥物管理局煙草制品中心敲定了一項(xiàng)“視同”法規(guī)，將其煙草相關(guān)監(jiān)管權(quán)限擴(kuò)展至含尼古丁的電子煙中，其研究依據(jù)重點(diǎn)包含了對電子煙毒性的研究[10]。

根據(jù)《OECD 487化學(xué)品測試方法 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)》的要求，中國倉鼠肺細(xì)胞（Chinese hamster lung，CHL）是體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)常用的生物測試體系之一。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)是遺傳毒性組合策略試驗(yàn)之一[11-12]。該試驗(yàn)可以確定和評價(jià)化學(xué)品誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核形成的能力，從而判斷受試物是否屬于致突變物。

目前，未見電子煙液能否誘發(fā)體外培養(yǎng)的中國倉鼠肺細(xì)胞微核形成的相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步評估電子煙液的安全性，本研究通過體外微核試驗(yàn)來評價(jià)電子煙液的致突變性，為電子煙液的安全使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

電子煙液購買于市售商業(yè)成品，主要成分為天然植物甘油、醫(yī)用級丙二醇、植物提取物、天然香精，煙油容量為每顆2 mL，尼古丁含量為30 mg/mL，生產(chǎn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號為Q/441900DGMK 001-2020。

細(xì)胞松弛素B、絲裂霉素C 和環(huán)磷酰胺購自于Sigma 公司。秋水仙堿、NADP-Na2和G-6-P-Na2購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

中國倉鼠肺細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。

1.3 受試物濃度的選擇

電子煙液不溶于去離子水，選擇二甲亞砜作為溶劑。試驗(yàn)選用3個(gè)終濃度（1.25、2.50和5.00 μL/mL）檢測其對中國倉鼠肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性。染毒前，用移液器吸取500 μL 電子煙液，再移取約500 μL 二甲亞砜定容至1 mL，配成最高劑量為500 μL/mL 的電子煙液母液，通過倍比稀釋，獲得其他劑量組的電子煙液母液。染毒時(shí)，最高劑量組從500 μL/mL的電子煙液母液中移取100 μL，加入9 900 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)液中，至總體積為10 mL，配成含電子煙液為5.00 μL/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，用于細(xì)胞染毒培養(yǎng)。其他劑量組或溶劑對照組（二甲亞砜）從對應(yīng)母液中吸取100 μL電子煙液母液或相同體積的二甲亞砜，分別加入9 900 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液中，至總體積為10 mL，用于細(xì)胞染毒培養(yǎng)。此時(shí)二甲亞砜濃度約為0.5%，滿足OECD 487中二甲亞砜最高濃度不高于1%的要求。

細(xì)胞毒性的確定依據(jù)胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)（cytokinesis block proliferation index，CBPI）進(jìn)行判定。

式中，CBPI=1等同于100%細(xì)胞生長抑制；500為觀察的細(xì)胞總數(shù)。

式中，T=受試物組，C=溶劑對照組

1.4 試驗(yàn)染毒程序

將適量細(xì)胞懸液加入新的12孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞長勢良好，可見大量分裂狀態(tài)細(xì)胞時(shí)，在相應(yīng)12孔板中分別加入不同劑量的試驗(yàn)樣品、溶劑對照品或陽性對照品。試驗(yàn)分為有代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組（4 h，+S9）、無代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組（4 h，-S9）和無代謝活化系統(tǒng)連續(xù)處理組（24 h，-S9）3 種處理方式，每種處理方式均設(shè)溶劑對照組和陽性對照組，所有組別均設(shè)兩個(gè)平行樣。短時(shí)處理組，試驗(yàn)樣品與細(xì)胞作用4 h 后棄去培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，然后加入0.02 mL 細(xì)胞松弛素B，再用含10%胎牛血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。無代謝活化系統(tǒng)連續(xù)處理組，在不加代謝活化系統(tǒng)條件下，使試驗(yàn)樣品和細(xì)胞松弛素B 與細(xì)胞連續(xù)作用約24 h。

1.5 制片和鏡檢

染毒結(jié)束后，棄上清液，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次。細(xì)胞經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定后，用0.1%吖啶橙對每孔進(jìn)行染色，然后于熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。鏡檢時(shí)每個(gè)濃度組至少觀察2 000 個(gè)雙核細(xì)胞，記錄含微核的雙核細(xì)胞數(shù)，鏡檢結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總并統(tǒng)計(jì)分析。

微核率/‰=（含微核的雙核細(xì)胞數(shù)/觀察雙核細(xì)胞總數(shù)）×1 000‰

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用卡方檢驗(yàn)的方法對各組雙核細(xì)胞微核率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示組間差異的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電子煙液對中國倉鼠肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性

通過計(jì)算胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)法來評估電子煙液對中國倉鼠肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在測試劑量范圍內(nèi)，隨著電子煙液濃度的升高，對中國倉鼠肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性升高。電子煙液在最高測試濃度為5 μL/mL時(shí)，（4 h，-S9）、（4 h，+S9）和（24 h，-S9）條件下染毒的細(xì)胞毒性分別為18.95%、17.16%和20.30%，具體見表1。所有染毒濃度組對中國倉鼠肺細(xì)胞的抑制率均低于50%，依據(jù)OECD 指導(dǎo)原則487 的要求，該試驗(yàn)選用的濃度適用于本研究。

表1 電子煙液對中國倉鼠肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 電子煙液對中國倉鼠肺細(xì)胞的遺傳毒性

本實(shí)驗(yàn)通過檢測電子煙液誘發(fā)體外培養(yǎng)的中國倉鼠肺細(xì)胞微核形成率來確定和評估其致突變能力，各劑量組微核率見表2。

表2 電子煙液誘發(fā)中國倉鼠肺細(xì)胞微核形成的試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)樣品在1.25、2.50 和5.00 μL/mL 劑量下，無代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組（4 h，-S9）的微核率分別為2.50‰、1.50‰及2.50‰，有代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組（4 h，+S9）的微核率分別為1.50‰、2.00‰及1.50‰，無代謝活化系統(tǒng)連續(xù)處理組（24 h，-S9）的微核率分別為1.50‰、1.00‰及1.50‰，與溶劑對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），試驗(yàn)結(jié)果為陰性。陽性對照組（4 h，-S9）、（4 h，+S9）及（24 h，-S9）條件下染毒的微核率分別為37.50‰、36.00‰及22.50‰，與溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明試驗(yàn)體系穩(wěn)定。

3 討 論

在有和無代謝活化系統(tǒng)處理?xiàng)l件下，各染毒濃度組電子煙液在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)中為陰性結(jié)果，表明該電子煙液在本測試濃度范圍內(nèi)，對CHL細(xì)胞無致突變作用。

Trifunovic 等[13]用含尼古丁和不含尼古丁的電子煙液處理V79 肺成纖維細(xì)胞，HPRT 試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)得到陰性結(jié)果，顯示其無致突變性，但電子煙液影響了V79 細(xì)胞的正常代謝，能誘發(fā)V79 肺成纖維細(xì)胞線粒體功能損害，使病灶黏附蛋白上調(diào)。Platel等[14]通過標(biāo)準(zhǔn)彗星試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和Pig-a基因突變試驗(yàn)，比較不同功率電子煙和傳統(tǒng)香煙煙霧經(jīng)口鼻暴露4 d、3個(gè)月及6 個(gè)月對小鼠遺傳毒性和誘變潛力的影響，其研究表明，大功率電子煙和傳統(tǒng)香煙能引起小鼠的肺和肝臟細(xì)胞的DNA氧化損傷，但彗星試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和Pig-a基因突變試驗(yàn)結(jié)果亦均為陰性。Thorne等[15]通過體外細(xì)胞基因突變試驗(yàn)，比較煙草產(chǎn)生的總顆粒物和電子煙液對L5178Y 細(xì)胞致突變性的影響，結(jié)果顯示，煙草產(chǎn)生的總顆粒物具有致突變性，而電子煙液對L5178Y 細(xì)胞無致突變性。Farsalinos 等[16]發(fā)現(xiàn)加熱后電子煙液形成的產(chǎn)物能誘使細(xì)胞發(fā)生DNA交聯(lián)和單雙鏈斷裂，如果得不到及時(shí)修復(fù)，這些可能會(huì)導(dǎo)致微核的形成。Guo 等[17]的研究也表明電子煙液可以在不同類型的口腔細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA損傷、氧化應(yīng)激、DNA雙鏈斷裂、細(xì)胞凋亡，臨床研究表明電子煙使用者的N'-亞硝基鳥嘌呤、丙烯醛DNA 加合物、基因調(diào)節(jié)和乳酸脫氫酶表達(dá)水平顯著高于非使用者，而嘌呤/嘧啶位點(diǎn)水平顯著低于非使用者。上述研究結(jié)果存在一定差異的原因可能有研究用生物測試體系不同、電子煙液尼古丁含量不同、電子煙液組分不同、染毒方式不同以及檢測終點(diǎn)不同等[18-19]。雖然這些研究的結(jié)果表明電子煙液能夠引起細(xì)胞氧化損傷、DNA損傷，但標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)表明電子煙液對測試生物體系無明確致突變作用，這和我們目前的研究結(jié)果相互印證。

綜上所述，電子煙液的遺傳毒性尚不明確，雖然其能夠引起細(xì)胞氧化損傷，但還不能確定其是否屬于致突變物，還需進(jìn)一步進(jìn)行遺傳毒性組合試驗(yàn)或探究新的遺傳毒性評價(jià)方法，以確定電子煙液是否具有遺傳毒性。