細胞分裂周期相關因子2的研究進展

杜 威，李仁燕，楊 丹，

（1．重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶 400010；2．重慶市人口和計劃生育科學技術研究院，重慶 400020）

腫瘤的發生發展是一個十分復雜的過程，表現出不同的生物學特征，通常具有基因組不穩定性的特征[1]。大多數腫瘤細胞具有形態與功能的改變。細胞核結構及染色體的改變是許多腫瘤診斷、分期和預后評估的重要生物標記。

細胞分裂周期相關因子2（cell division cycle associated 2，CDCA2）作為細胞周期分裂相關調控因子，也是磷酸酶1γ（phosphatase 1γ，PP1γ）的調節亞基[2]，CDCA2/PP1γ復合體對多個信號通路十分重要。蛋白的磷酸化調控是一些信號通路的“開關”，具有使信號通路激活或失活的作用。CDCA2/PP1γ與蛋白激酶共同介導特定底物的磷酸化修飾，在細胞染色體分離、染色體重建、核膜重塑、異染色體形成與DNA損傷修復等方面均具有重要功能，并且它與腫瘤的發生、發展、預后具有密切的關系。深入探索CDCA2分子的功能及其作用機制，有利于為腫瘤的靶向治療、診斷提供新的理論依據。

1 概 述

CDCA2基因最早于2001 年被發現，定位于8 號染色體（8p21.1），并被認為是一種新的細胞周期相關基因[3]。研究發現，CDCA2是磷酸酶PP1的調節亞基，在有絲分裂后期它可以招募PP1 定位到染色體（recruits PP1 onto mitotic chromatin at anaphase，Repo-Man），因此也被命名為Repo-Man[2]。CDCA2基因具有復雜的結構與功能，含有1 023個氨基酸，其全長的結構域包括：N 端（1～135 殘基）與importin β蛋白相互作用的結構域，中間區域為分別與磷酸酶PP1、PP2A 相互作用的RVTF結構域、LSPI結構域以及與CDK1/Cycllin B結合的一段保守序列（403～550 殘基），C 端為與組蛋白結合（histone bingding，HB）的結構域[4-6]。研究發現，CDCA2 的N 端結構域可被激酶CDK/Cyclin B 磷酸化修飾，其磷酸化狀態影響CDCA2 與importin β的相互作用，并且這種相互作用在有絲分裂后期才開始形成，并能維持到細胞間期[5，7]。RVTF結構域是PP1與CDCA2相互作用的關鍵位點，當RVTF 突變為RATA 時，它們之間的相互作用明顯減弱。此外，CDK 磷酸化中間保守序列中的S400、T412、T419 位點也可以明顯抑制PP1 與CDCA2 的相互作用。相反，CDK磷酸化LSPI結構域，CDCA2與PP2A的相互作用增強[5]。簡言之，CDCA2 與相關蛋白的集合能力與其磷酸化狀態密切相關，其功能會隨著CDK/CyclinB 在細胞周期中的活性變化而變化。因此，CDCA2在不同時期的功能具有明顯差異，導致了其功能的復雜性。

研究表明，CDCA2 的定位會隨著細胞周期變化。細胞間期，CDCA2定位于細胞核；當細胞進入有絲分裂早期，定位至細胞質；而隨著有絲分裂后期開始，重新定位到染色體[5]。接下來，本文將對CDCA2的不同功能進行闡述。

2 CDCA2調控染色質重組、核膜重塑與異染色質的形成

細胞增殖過程中，有絲分裂前期染色體凝集是實現后期染色體均等分離的重要條件[8]。如果染色體前期凝集或后期解凝集過程異常，細胞分裂將出現染色體分離滯后，這是導致子代細胞染色體異倍體出現的重要原因之一。染色體凝集主要受由凝縮蛋白和組蛋白翻譯后修飾共同調控[8-11]，凝縮蛋白由染色體結構維持蛋白（structure maintenance of chromosome，Smc）2 和4 及3 種非Smc 蛋白組成的。研究表明，在DT40 細胞中敲除Smc2，影響后期凝縮蛋白從著絲粒附近脫離，導致細胞產生大量的染色體分離滯后，而外源過表達與PP1結合缺陷的突變體CDCA2RATA能夠挽救這一現象[12]。此外，被激酶Aurora B磷酸化的組蛋白H3第10位絲氨酸（H3S10ph），是調控有絲分裂前期染色體凝集狀態的重要標記分子[13]。后期CDCA2招募PP1定位染色體，使H3S10ph 去磷酸化，抑制凝縮蛋白與染色體結合[14-16]，有利于姐妹染色單體的分開。因此，CDCA2/PP1 對子代細胞完成正確的染色體重塑是必不可少的。

細胞核膜在有絲分裂前期破裂，末期重新形成。末期核膜重塑（nuclear envelope organization）是保證子代細胞基因組穩定的重要過程[17]。如前所述，在有絲分裂后期開始時，CDCA2的定位重新轉移至染色體外圍（chromosome periphery）。研究表明，CDCA2 的N 端（1～135 aa）與 核 纖 層 蛋 白Importin β、Nup153具有直接或間接的相互作用，可促進Importin β等蛋白定位染色質，調控末期核膜重塑，并且這種機制對核膜重塑的調控是不依賴于PP1的[5，18-19]。見圖1。當敲除CDCA2的N端或使N 端持續磷酸化時，CDCA2 與Importin β的相互作用明顯減弱，細胞出現顯著的核膜重塑缺陷[5]。還有研究表明，有絲分裂末期，CDCA2 的第762 位賴氨酸（K62）被蘇木化修飾（SUMO），可增強CDCA2 與核纖層蛋白Lamin A 的相互作用，CDCA2/PP1使Lamin A去磷酸化，可促進子代細胞核纖層的再生[20]。由此可見，CDCA2與核纖層蛋白的相互作用及調控，對核膜重塑十分關鍵。

圖1 CDCA2與其他蛋白結合位點示意圖[5]

細胞完成有絲分裂后，進入間期，CDCA2/PP1同樣具有重要的功能。CDCA2 通過與核孔復合物（nuclear pore complex，NPC）成員Nup153 間接作用，定位在染色體外圍與核籃（nucleopore basket），CDCA2/PP1 使組蛋白H3 第28 位 絲 氨 酸（H3S28）去磷酸化，促進異染色質蛋白1（heterochromatin protein1，HP1）焦點的再形成，觸發異染色質標記分子H3K27me3、H3K9me3 的局部富集，其中CDCA2 與H3K27me3具有直接相互作用，調控異染色質形成[21]。研究還表明，CDCA2 與組蛋白變體H2AZ、H3.3 富集于亞端粒（subtelomeric）區域，對該區域多梳調基因的表達十分重要[21]。綜上，有絲分裂末期，CDCA2/PP1 參與調控染色質重組與核膜重塑；間期，具有調控異染色質的形成的功能。

3 CDCA2與激酶Aurora B激酶

Aurora B 作為染色體乘客復合體（chromosomal passenger complex，CPC）唯一的蛋白激酶成員[22-25]，可磷酸化定位著絲粒的MACK、Ndc80C/Hec1等蛋白，具有糾正著絲粒-微管連接錯誤的功能，它是維護染色體整倍體的重要分子[26-30]。CPC 在著絲粒處的定位，具有糾正著絲粒-微管連接錯誤的功能。有絲分裂前期，CPC主要定位于染色體臂，中期被招募至著絲粒附近。激酶Haspin磷酸化組蛋白H3的第3位蘇氨酸（H3T3ph），是負責招募CPC 至著絲粒定位的重要標記分子之一[31-34]。研究表明，CDCA2/PP1 復合體可使H3T3ph 去磷酸化[35]。早期，被CDK 多位點磷酸化的CDCA2 與PP1 相互作用較弱，可保護H3T3ph 水平，促進其對Aurora B 著絲粒定位的招募。同時，激酶Aurora B、PLK1多位點磷酸化Hapin，可促進Haspin的活性，增強H3T3ph[36]；Aurora B磷酸化CDCA2的第893位絲氨酸（S893ph）。前中期，S893ph是促使CDCA2從染色體脫離的關鍵標記分子[4]，CDCA2從染色體脫離可維持H3T3ph水平。由此可見，CDCA2 既作為Aurora B 的底物，同時也能調控Aurora B在著絲粒處募集，影響其對著絲粒-微管連接錯誤的糾正功能。隨著細胞開始進入有絲分裂末期，磷酸酶PP2A 靶向S893ph，從而使S893ph 水平降低，使CDCA2 重新定位至染色體，CDCA2/PP1 靶向組蛋白H3 的尾部，使H3T3ph、H3S10ph等分子去磷酸化，調控染色體正確分離。見圖2。

圖2 CDCA2與磷酸酶PP1、PP2A協調CPC調控H3T3ph[5，7]

此外，研究還發現CDCA2、Aurora B分別在某些腫瘤中表達上調，但兩者之間的關系并不清楚。進一步分析CDCA2 與Aurora B均表達上調的腫瘤，發現其主要原因是在腫瘤細胞周期中兩者均經歷了蛋白降解調控途徑，并且2種蛋白水平出現類似的變化趨勢。當Repo-Man 過表達時，腫瘤細胞對Aurora B 抑制劑較敏感。當Aurora B 和Repo-Man 共同上調時，腫瘤細胞對Aurora B抑制劑更敏感[37]。該研究還發現，在未來對腫瘤的治療過程中，可將Aurora B 抑制劑與CDCA2 靶點聯合作用治療腫瘤，增加藥物靶向性。

4 CDCA2與DNA損傷修復

細胞在復制、新陳代謝等內源性因素或電離輻射、化療藥物等外源因素的情況下，可能會產生不同程度的DNA 損傷[38]。針對這些損傷，細胞進化出一些保護機制，通常稱為DNA損傷反應（DNA damage response，DDR），包括DNA損傷修復與細胞周期檢查點等信號傳導通路[39-40]。DDR 的激活依賴于共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和其他激酶蛋白的磷酸化，PP1等磷酸酶是調控DNA損傷修復的重要蛋白分子[41-43]。如果DDR 調控異常，將導致細胞基因組不穩定，出現細胞生長停滯、死亡，甚至導致腫瘤的發生[44]。關于CDCA2 在DNA 損傷修復中的功能探索，Peng 等[45]研究報道，在非洲爪蟾卵母細胞中，CDCA2通過靶向PP1負調控ATM活性，從而影響DNA 損傷檢查點。敲低CDCA2，ATM 活性明顯增強；過表達野生型CDCA2 可明顯抑制ATM 活性，而過表達與PP1結合位點缺失的突變體，ATM活性并不會受到抑制[45]。

細胞發生DNA損傷時，細胞周期檢查點被激活，延遲細胞周期進程，直到這些損傷被修復。細胞周期檢查點包括G1/S、S期、G2/M，檢查點的異常調控可導致染色體畸變，是腫瘤發生、發展的重要原因之一[46]。據報道，CDCA2在肺腺癌中高表達，敲低CDCA2，可使CCNE1 表達下調，細胞被阻滯在G1/S期，過表達CDCA2 可明顯促進細胞增殖。CDCA2 在KYSE450、TE13 食管鱗狀細胞癌細胞中表達也上調，敲低CDCA2，并使用X 射線照射處理，細胞出現明顯的G2/M 阻滯[47]。此外，在口腔鱗狀細胞癌中，與單獨使用順鉑處理相比，敲低CDCA2與順鉑聯合使用，可明顯促進細胞自噬[48]。這表明，抑制CDCA2 表達在增強放療效果和增強致DNA 損傷類化療藥物療效等方面具有很大潛力，進一步對CDCA2的深入研究可為開發新的抗腫瘤藥物提供理論依據。

5 CDCA2與腫瘤

自CDCA2基因被鑒定以來，關于Repo-Man 表達水平與腫瘤惡性程度間相關性的首次報道是對神經母細胞瘤的研究。Ryu 等[49]通過對神經母細胞瘤患者的生存分析發現，CDCA2 高表達的患者，其預后明顯較差[49]。通過對比不同腫瘤與正常組織中的CDAC2 表達，大多數腫瘤組織的CDCA2 均表達較高。除此之外，CDCA2 還在黑色素瘤、肝癌、結直腸癌、前列腺癌、食管鱗狀上皮癌等腫瘤細胞中表達上調[50-53]。研究表明，在比較一系列不同惡性程度的黑色素瘤細胞的基因表達譜中發現，CDCA2主要源自原發性病灶，提示它的高表達與黑色瘤的惡性程度相關[54]。在肝癌發展過程中，CDCA2高表達，促進肝癌細胞的增殖，其機制是激活PI3K/AKT 信號通路，靶向Cyclin D1，調控細胞周期[50]；同時研究表明，CDCA2高表達與肝癌的病理分級和TNM分期呈正相關，并且它可以作為肝癌預后判斷的標記分子[55]。此外，在肝癌中，低甲基化的CDCA2可顯著降低T 細胞和細胞毒性淋巴細胞的免疫浸潤水平[56]。在結直腸癌中，CDCA2 的高表達可上調Cyclin D1 的表達，促進細胞周期進程。在前列腺癌細胞中，CDCA2與前列腺癌進展正相關[52]，研究表明，CDCA2 可能通過HIF-1a/SMAD3 信號通路調控前列腺癌的發生發展。在食管鱗狀細胞癌中，CDCA2的高表達與KYSE450 和TE13 細胞系的增殖密切相關，CDCA2 通過細胞周期與G2/M檢查點，調控食管鱗狀細胞癌的抗輻射能力。

綜上，CDCA2 表達水平上調可能是人類腫瘤的一個特征，它在晚期癌癥中的過度表達，可能與腫瘤的不良預后相關。盡管還需要更多的科學數據來驗證CDCA2與腫瘤預后的關系，具體的分子機制還需要進一步探索，但是以上關于CDCA2與腫瘤關系的初步研究，表明CDCA2與腫瘤發生發展具有密切的關系。

6 結語與展望

目前為止，關于CDCA2調控基因組穩定性的研究，一方面是在有絲分裂早期，CDCA2/PP1 通過H3T3ph 分子調控CPC 復合體著絲粒定位，保證染色體正確分裂；后期，CDCA2與凝縮蛋白共同調控著絲粒附近姐妹染色單體的凝聚力，維持染色體的正常結構；末期，CDCA2/PP1 通過介導Importin β、Nup153、Lamin A 等蛋白分子的染色質定位，調控核膜重塑；分裂完成后的間期，CDCA2與H3K27me3直接相互作用，調控異染色質的形成。另一方面是在DNA 損傷時，CDCA2 通過靶向ATM、細胞周期檢查點等參與調控DNA 損傷修復過程。然而，目前關于CDCA2定位由前中期定位胞漿到后期轉移至染色體定位的具體調控機制仍不清楚。雖然已有文獻報道，在前中期，Aurora B、CDK1 磷酸化CDCA2，使其定位至胞漿，但是是否還存在其他激酶共同參與，以及后期去磷酸化后的CDCA2又被哪些分子將其招募染色體定位是不明確的，它們之間具體的調控機制還需要進一步的探索。同時，CDCA2與染色體結合的區域是否受組蛋白翻譯后修飾分子調控，及其是否會隨著這些標記分子在細胞周期中的變化而改變；以及CDCA2 招募ATM 等分子參與DNA 損傷修復是否受這些組蛋白翻譯后修飾分子的調控仍需進一步研究。

關于CDCA2與腫瘤的相關研究還處于初步階段。目前，雖然發現CDCA2的高表達與腫瘤密切相關，但是關于其對腫瘤發展、預后相關的分子機制還十分不清楚。因此，還需要對CDCA2蛋白進一步深入研究，為腫瘤的早期診斷、靶向治療等提供新的理論依據。