慢性間歇性缺氧缺氧誘導因子1α與血紅素氧合酶1 在肺小動脈中的表達

董學峰，孫禎

（泉州醫學高等專科學校，福建泉州 362100）

睡眠呼吸暫停綜合征（Sleep Apnea Syndrome，SAS）是一種常見的呼吸系統疾病，發病率在2.6%～8.4%之間。其發生機制主要是在睡眠狀態下，上呼吸道軟組織、肌肉的塌陷引起呼吸道阻塞或狹窄，以及在睡眠期間，上呼吸道肌肉對缺氧和二氧化碳潴留的刺激反應性下降，從而產生慢性低氧血癥和高碳酸血癥。睡眠呼吸暫停綜合征可進一步導致機體發生許多病理生理變化，可引起全身多系統、多器官的損害。

SAS導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生與發展的機制十分復雜。目前的研究結果是：SAS長期反復發生缺氧導致冠狀動脈內皮功能紊亂，引起血管舒張因子合成分泌減少，血管收縮，加重缺氧致動脈內皮損傷；SAS間歇性缺氧使游離氧自由基及炎癥介質升高，出現全身性炎癥反應，產生內皮血管舒張功能障礙，導致動脈粥樣硬化的出現；SAS間歇性缺氧刺激交感神經興奮性增高，并激活腎素—血管緊張素—醛固酮系統，導致心率增快、血壓升高、心肌代謝加快等一系列反應，使冠脈供血與心肌代謝之間的平衡被破壞，心肌相對缺血，導致內皮進一步損傷，促使斑塊形成，加快了冠心病的發生和發展。在一定程度上，呼吸睡眠暫停缺氧的嚴重程度與冠狀動脈狹窄程度呈正相關。冠心病合并SAS患者的預后相對較差，這進一步提升了冠心病患者的病死率。早期發現合并SAS，及時治療，對冠心病患者改善預后、減少心血管事件發生具有非常重要的臨床意義。

SAS可導致呼吸系統疾病、心血管系統疾病、神經系統疾病和內分泌系統疾病的發病率升高，例如慢性肺源性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心律失常、高血壓、腦卒中、2型糖尿病等[1]。如果患者不及時發現以上病癥并進行有效治療，這些病癥將對患者的生命產生嚴重的威脅。在發病初期，如果患者能進行有效的治療，可預防各種并發癥的發生、提高生活質量、降低病死率。SAS的病理生理特征是慢性間歇性缺氧（Chronic Intermittent Hypoxia，CIH）。CIH指長期反復間歇低氧/再氧合交替出現，引起組織缺血再灌注損傷。一方面，長期缺氧可以導致血管內皮細胞損傷、血管活性因子分泌平衡失調、血管收縮活性因子相對增加，使肺血管收縮，增加血管阻力；另一方面，長期缺氧可以導致血管壁張力升高，促使血管壁增生，從而導致低氧性肺血管重塑（Hypoxic Pulmonary Vascular Remodeling，HPVR），進一步引起缺氧性肺動脈高壓（Hypoxic Pulmonary Hypertension，HPH）。肺動脈高壓是以肺血管抵抗和肺動脈壓力升高為主要特征的持續不可逆性疾病，肺動脈高壓是慢性肺心病發生發展過程中重要的病理生理環節，最終可能導致右心衰竭甚至死亡。目前，學界已有與CIH誘導HPH的機制相關的研究，但相關學者對于HPVR形成的細胞機制還不太清楚，也沒有代表性的細胞表型標記物，學者們還需要進一步進行研究。筆者制作了該類動物模型，擬從CIH對血清HIF-1及HO-1的影響角度探討HIF-1和HO-1在CIH對HPH發生及發展過程中的可能機制。HPH的治療一直是研究熱點。筆者希望本研究能為慢性肺源性心臟病的防治提供理論依據。

一、材料與方法

（一）制作慢性間歇性缺氧模型

SPF級雄性C57BL/6小鼠20只 ，體質量18～21g，購自福建醫科大學實驗動物中心。筆者采取隨機數字表法，把20只小鼠隨機分為缺氧組（10只）和 常氧組（10只）。筆者將常氧組的10只小鼠放在室溫23℃～25℃、濕度40%～50%的SPF級動物實驗室飼養，將缺氧組的10只小鼠放在缺氧箱內飼養，并通過氧氣監測儀的監測使缺氧箱的氧濃度維持在6±1% ～21±1%之間[2］，其他條件與常氧組相同。

（二）取材

在小鼠間歇性缺氧30天后，筆者先給小鼠稱重，再用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)給小鼠的腹腔注射麻醉，固定小鼠。筆者給小鼠的胸部皮膚進行消毒，穿刺小鼠心臟取血。取血后，筆者沿小鼠的劍突向上切開至胸腔，取出肺組織，置于10%甲醛中浸泡，固定1周。

（三）肺小動脈的HE 染色光鏡觀察

取出肺組織，經過脫水透明；浸蠟和包埋；切片和貼片，每張片厚度為4um；再進行蘇木精-伊紅(HE)染色和封片。筆者使用光學顯微鏡觀察肺小動脈形態結構，用顯微鏡實時攝像系統攝像，隨機選取每只小鼠的5張肺組織切片，直徑約100um肺小動脈，橫斷面積較圓的3支，在血管內膜的十個等距點測量內膜和中膜的厚度，再取平均值。筆者使用Image-pro plus 6.0圖像軟件進行分析。

（四）血清HIF-1ɑ 和HO-1 水平測定

筆者采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）提取血漿，按說明書操作。

二、統計學方法

使用SPSS 26.0統計軟件包，計量資料以表示，組間差異用t檢驗。有差異者，筆者采用LSP兩兩對比分析法，P＜0.05，差異有統計學意義。

三、結果

（一）常氧組和缺氧組小鼠肺小動脈形態學比較

1.兩組小鼠的肺小動脈形態學，見圖1、圖2

圖2 缺氧組小鼠的肺小動脈形態學

常氧組：血管壁較薄、腔較大。內膜的內皮細胞在管腔面均勻分布，光滑平整。中膜的平滑肌細胞和彈性纖維層呈環形規則排列。管壁三層結構分界清楚。

缺氧組：管腔變窄，較粗糙。內膜增厚，內皮細胞部分脫落，內彈力膜部分斷裂，內彈力膜厚薄不一。中膜平滑肌細胞增生肥大、結構紊亂。彈性纖維層彈力蛋白增多、結構紊亂，纖維組織增生，中膜層增厚。

2.兩組小鼠的肺小動脈內膜厚度及中膜厚度比較，見表1

表1 兩組小鼠的肺小動脈內膜及中膜厚度比較（μm，n=10）

與常氧組小鼠對比，缺氧組小鼠的內膜及中膜均增厚，P＜0.05，差異均有統計學意義。

（二）兩組小鼠的血清HIF-1ɑ 和HO-1濃度比較，見表2

表2 常氧組小鼠與缺氧組小鼠的血清HIF-1ɑ和HO-1 濃度比較（pg/ml，n=10）

與常氧組小鼠比較，缺氧組小鼠的血清HIF-1ɑ和HO-1濃度均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

（三）缺氧組小鼠的肺小動脈內膜厚度與血清HIF-1ɑ 和HO-1 的相關性

表3 缺氧組小鼠的肺小動脈內膜厚度與血清HIF-1ɑ和HO-1 的相關性

缺氧組小鼠的肺小動脈內膜厚度與血清HIF-1ɑ的相關性r=0.751，P＜0.05，呈正相關；與血清HO-1的相關性r=0.887，P＜0.05，呈正相關。

（四）缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ 和HO-1 的相關性

表4 缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ和HO-1 的相關性

缺氧組小鼠的肺小動脈中膜厚度與血清HIF-1ɑ的相關性r=0.742，P＜0.05，呈正相關；與血清HO-1的相關性r=0.903，P＜0.05，呈正相關。

四、討論

本實驗顯示：缺氧組小鼠肺小動脈的病理變化與血清HIF-1ɑ和HO-1密切相關，這與目前的研究結論是一致的。

CIH可引起HIF-1表達升高。HIF-1為異源二聚體的核轉錄因子，是在缺氧時最主要的核轉錄調節基因之一。在缺氧狀態下，HIF-1在細胞核內與下游上百種靶基因序列結合，如內皮素、血管內皮生長因子、促紅細胞生成素等，介導糖酵解、血管新生、紅細胞生成、細胞凋亡、細胞增殖及膠原合成等生物學效應。為組織細胞提供氧和營養以適應機體缺氧反應是機體許多缺氧反應信號轉導的共同通路[3]。機體先激活缺氧反應基因轉錄的DNA結合蛋白，再與其靶基因相結合，再調控轉錄及轉錄后過程，導致機體對缺氧發生適應性反應。缺氧產生的活性氧簇激活HIF-1α與 HIF-1β兩個亞基構成的異二聚體HIF-1分子，與CIH病理生理機制相關。HIF-1β在缺氧狀態下幾乎沒有發生改變，穩定表達。HIF-1α不僅是HIF-1的活性亞基，也是調節亞基。細胞內氧濃度能調節HIF-1α的蛋白穩定性和轉錄活性。在常氧狀態下，HIF-1α在合成后經蛋白酶和泛素途徑被迅速降解。在缺氧狀態下，因阻斷羥基化反應，HIF-1α的降解減少，HIF-1α積聚和活化，其升高呈指數倍的增長。異常升高的HIF-1α導致調控因子的調控功能出現紊亂，引起血管活性物質的分泌和降解、血管舒縮、細胞增殖等功能均產生異常，進一步引起肺小動脈痙攣收縮、血管壁增生。肺動脈平滑肌細胞的增殖與凋亡是決定缺氧性肺動脈高壓形成的重要細胞病理學基礎，最終導致HPVR等變化，引起HPH的產生。

CIH還可引起HO-1表達升高，HO-1可以抑制慢性缺氧狀態下肺小動脈血管平滑肌細胞增生重構、中層增厚管腔狹窄及HPH的產生。目前的研究表明血紅素氧合酶（HO）是目前發現最易受誘導的酶之一，它是將血紅素降解為一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子的起始酶和限速酶。血紅素氧合酶（HO）具有HO-1、HO-2和HO-3 三種同工酶，他們都能分解血紅素，并產生CO和膽紅素。只有HO-1是HO唯一的誘導型。作為一種新的舒血管物質，HO在CIH的刺激下，可引起紅細胞生成增多，并破壞血紅素的增加，不僅對限速酶HO-1有明顯的誘導作用，而且能提高代謝終產物CO的產量。HO-1可存在于呼吸系統、心血管系統、神經系統、泌尿生殖系統、消化系統和內分泌系統等全身多個系統中，在對抗應激反應時起著非常重要的作用。HO催化降解血紅素的產物CO是內源性CO最主要的來源，CO是繼一氧化氮（NO）之后被發現的另一種能快速自由地通過各種生物膜的新型細胞信使分子，內源性CO可在血管內皮細胞、平滑肌細胞及神經元細胞中生成[4]。CO不僅具有舒張血管平滑肌細胞的作用，而且能調節血管壁張力、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制炎癥反應、抑制血小板聚集及增加組織的血液灌注等生物學效應，這些生物學功能在HPH的病理發生發展過程中發揮著重要作用。在CIH中，HO-1／CO體系可代償性增加，還參與了機體對HPVR的自身調節。內源性HO／CO體系在HPH形成中的生物學效應機制是：CO通過自分泌或旁分泌的方式激活細胞質中的鳥苷酸環化酶（sGC），CO與鳥苷酸環化酶（sGC）中的血紅素基團上的鐵原子結合，活化的sGC再催化GTP生成cGMP，cGMP的生成減少Ca2+內流，導致細胞質內的Ca2+降低，使血管舒張和抑制血小板凝集。CO還可以通過細胞周期特異性轉錄因子E2F-1的轉錄的影響，直接干預細胞的G1／S期。CO能抑制分裂素、ET-1、PDGF-β和VEGF等細胞因子，間接干預細胞中的G0／G1期，從而抑制血管平滑肌細胞的增殖。CO不僅能抑制肺小動脈損傷后新生內膜的形成，而且能抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞的過度增殖，從而發揮生物學效應[5]。

綜上所述，CIH可導致HIF-la的表達增加，并調控其下游的缺氧反應基因HO-1的轉錄。二者協同作用，發揮抑制抗氧化損傷、血管平滑肌細胞增殖、舒張血管、抑制血小板凝聚等作用。CIH構成了保護肺小動脈的HIF-1a/HO-1通路，通過對纖維蛋白溶解級聯反應的調節來降低致死率[6]。但對于HIF-1a和HO-1在CIH的發生及發展過程中的具體作用，以及其在臨床上的使用還需相關學者進行進一步研究，以此為研發高效的治療缺氧性肺動脈高壓的藥物提供更多理論依據。