電針對缺血再灌注后學習記憶障礙大鼠BDNF/TrkB/PI3K/Akt 通路的影響及對海馬神經元保護作用研究

蘇凱奇，呂轉，吳明莉，羅萌，高靜，聶晨晨，劉昊，馮曉東，*

腦卒中是我國人口壽命年減少的首要病因，缺血性腦卒中約占其中的87%［1-2］。腦卒中患者常存在不同程度的功能障礙，其中約2/3的患者出現執行功能/注意力、記憶、視空間等至少1 個領域的認知功能下降，嚴重影響患者的依從性和整體康復［3-4］。本課題組前期研究發現，神庭和百會是針刺治療腦卒中后認知障礙常用的穴位［5］，同時電針神庭、百會能夠有效改善卒中后患者認知功能，提高生活自理能力［6-7］，然而具體的作用機制仍需深入研討。腦源性神經營養因子（BDNF）可促進神經細胞發育、成熟，在維持神經元存活、增加神經遞質的合成中具有重要作用［8-9］。BDNF 與其特異性受體酪氨酸激受體B（TrkB）結合后，可激活下游磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，與細胞凋亡、自噬、突觸可塑性密切相關［8，10-11］。基于此，本研究通過構建大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）后學習記憶障礙大鼠模型，觀察了電針對大鼠海馬神經元的保護作用及對BDNF/TrkB/PI3K/Akt 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2021 年5 月—2022 年3 月選取60 只8 周齡健康雄性SD 大鼠，體質量180～220 g，SPF 級，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司〔動物許可證號：SCXK（魯）2019003〕。飼養于河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，保持室溫20～26 ℃，濕度50%～70%，12 h 光照，自由飲食、飲水。本研究嚴格遵循實驗動物倫理保護規定執行，并通過河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理審查委員會的批準（YFYDW2021030）。

1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉（上海氟德化工有限公司，貨號：21642-83-1），硫酸慶大霉素〔上海現代哈森（商丘）藥業有限公司，貨號：1405-41-0〕，線栓（北京西濃科技有限公司，貨號：2036A6），多聚甲醛（biosharp 生物科技，貨號：BL539A），中性樹膠（中國醫藥集團有限公司，貨號：96949-21-2），2%（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）TTC 染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：T8170），總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1200），蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：R0010），BCA 蛋白定濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PC0020），彩虹光譜蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PR1920）、增強型化學發光（ECL）顯色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PE0010），逆轉錄試劑盒〔翌圣生物科技（上海）股份有限公司，貨號：14601ES03〕，引物（金唯智生物科技公司），兔抗BDNF（美國Abcam，貨號：ab108319），TrkB 多克隆抗體（美國Abcam，貨號：ab187041），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗（美國Abcam，貨號：ab150077），兔抗磷酸化下游磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）（美國Abcam，貨號：ab278545），PI3K（美國Abcam，貨號：ab133595），磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：80455-1-RR），Akt（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：6-2-3-2-lg），GAPDH 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：60004-1-lg），PAGE 凝膠試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，貨號：PG112）。

Morris 水迷宮（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），針灸針、電針儀（蘇州醫療用品廠），病理切片機（德國徠卡，型號：RM2245），脫水機（德國萊卡公司，型號：ASP200S），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-L7），高速組織研磨儀（武漢Servicebio，型號：SWE-FP），PCR 儀（杭州比格飛序，型號：96B），蛋白濃度微量測定儀（美國Thermo，型號：NanoDropOne），熒光定量PCR 儀（西安天隆科技，型號：Gentier），酶標儀（美國Thermo，型號：MK3），電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad，型號：1658001，170-3930），凝膠成像系統（美國Bio-Rad，型號：GelDoc XR+）。

1.3 大鼠造模及分組 喂養1 周后稱重，按照體質量生成的隨機數字表進行分組，取24 只大鼠分為空白組（n=12）、假手術組（n=12），其余36 只大鼠采用Zea Longa 線栓法構建MCAO/R 模型［12］。大鼠術前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位，分離頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），結扎ECA 遠心端，夾閉CCA 近心端和ICA 遠心端，在ECA 分叉處剪一“V”形開口，用（0.26±0.02）mm 的硅膠涂層尼龍線栓從切口處插入至ICA 夾閉處，松掉ICA 動脈夾，繼續插入至輕微阻力為止，深度1.8～2.0 cm，記錄插栓時間，縫合切口。術后腹腔注射慶大霉素（2 U/只），連續3 d。缺血2 h 后，輕輕拉出長度約1 cm 線栓，復通血管以灌注。空白組僅予同等條件的捉抓，假手術組予麻醉后僅分離血管，不插栓。待假手術組和造模后的大鼠完全清醒后對大鼠進行Zea-Longa 評分（具體標準見表1），排除0 分和4 分的大鼠，24 h 后對假手術組和剩余造模大鼠開展水迷宮定位航行實驗。以假手術組平均逃避潛伏時間為參考值，若造模組大鼠平均逃避潛伏時間小于參考值的80%，則認為造模成功［13］。最終將造模成功的24 只大鼠隨機分為模型組（n=12）和電針組（n=12）。

1.4 電針治療 電針組于神庭、百會穴進行電針治療，腧穴定位依照《實驗針灸學》［14］。將大鼠置于特殊制作的治療架上，采用針灸針（0.3 mm×25 mm）向后斜刺3 mm 進針，連接GM01 電針儀，選用疏密波，電壓峰值6 V，頻率2～10 Hz，電流強度1～3 mA；30 min/次，1 次/d，連續治療14 d。治療期間關注大鼠狀態，避免針灸針脫落和大鼠跌落摔傷。模型組、空白組、假手術組只給予同等條件抓取，不予其他干預措施。

1.5 大鼠神經缺損程度與空間學習記憶能力評價 治療后第7、14 天由對實驗方案不知情的人員對大鼠進行Zea-Longa 評分，以此觀察各組大鼠神經功能缺損程度。通過水迷宮實驗評價大鼠空間學習記憶能力，包括（1）定位航行實驗：于治療第9～13 天8：00 及18：00 進行，由第1 象限開始按順時針順序依次將大鼠置入水中，大鼠通過游泳來尋找逃生平臺，記錄大鼠發現平臺所花費的時間（逃避潛伏期）。90 s 內未能找到平臺，由研究者將大鼠置于平臺上，并給予10 s 的休息時間，并記錄此大鼠的逃避潛伏期為90 s。（2）空間探索實驗：在治療進行第14 天時撤掉水池中的逃生平臺，其余不變，將大鼠面朝池壁，依次投放入水池內的4 個象限，記錄90 s 內穿越平臺有效區域次數。

1.6 TTC 染色觀察大鼠腦梗死體積 治療結束后，每組隨機選3 只大鼠麻醉后斷頭取腦組織，沖洗干凈，于-20 ℃冰箱中快速冷凍20 min 后沿冠狀面進行切片，切片厚度約2 mm，每個腦組織共切5 片。于2%TTC 染色液中37 ℃避光染色。染色后將腦切片按照順序擺放后拍照，應用Image J 軟件計算腦梗死體積占總體積的百分比。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬CA1 區神經元形態 干預結束后，每組隨機選3 只大鼠，麻醉后0.9%氯化鈉溶液和多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦組織，多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋切片。56 ℃烤片1 h，脫蠟步驟如下：切片置于松節油中8 min，4 次，然后于乙醇中梯度脫水。使用蘇木素染色5～10 min，采用純水將切片清洗至水色變清，使用1%鹽酸酒精分化2～3 s后使用純水清洗，氨水返藍，再次清洗。1%伊紅染色5～10 min，清洗1 min，乙醇脫水后中性樹膠封片待檢。

1.8 實時熒光定量PCR（RT-PCR）測定BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平 干預結束后，每組隨機選3 只大鼠，完全麻醉后取腦，在冰面上剝取海馬組織，置于無酶凍存管中-80 ℃冰箱保存。按100 mg 海馬組織∶1 mL 裂解液比例配置，勻漿器充分研磨，按照試劑盒說明書提取總RNA，置于冰上進行RNA 濃度測定。引物序列見表2。逆轉錄條件為37 ℃，15 min，98 ℃，5 min，結束后分裝并-20 ℃保存。RT-PCR 條件與方法按照說明書進行，基因相對表達量采用2-△△CT法計算。

表2 RT-PCR 引物序列Table 2 RT-PCR primer sequence

1.9 Western blotting 檢 測BDNF、TrkB 蛋 白 水 平 及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平 干預結束后，每組隨機選3 只大鼠，完全麻醉后取腦，在冰面上剝取海馬組織，置于無酶凍存管中-80 ℃冰箱保存。海馬組織稱重后，加入裂解混合液（RIPA 裂解液∶蛋白酶抑制劑∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）。使用勻漿器低溫充分研磨，4℃，12 000 r/min 離心15 min 后提取上清，采用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后加熱變性。制備聚丙烯酰胺凝膠，電泳，濕法轉膜，封閉1.5～2 h。4 ℃一抗（BDNF 1∶7 000、TrkB 1∶5 000、p-PI3K 1∶1 000、PI3K 1∶1 000、p-Akt 1∶1 000、Akt 1∶1 000、GAPDH 1∶10 000）孵育過夜。二抗（ 1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL 法顯影，凝膠成像拍照。使用Image J 軟件并以目的蛋白/內參灰度值計算蛋白相對表達量，PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平分別以磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）/PI3K、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）/Akt 表示。1.10 統計學方法 采用SPSS 24.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t 檢驗；重復測量數據采用兩因素重復測量方差分析；等級資料比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗，組內兩兩比較采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組大鼠神經功能缺損程度 術后2 h 模型組、電針組Zea-Longa 評分與空白組、假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），治療第7 天、治療第14 天模型組Zea-Longa 評分與空白組、假手術組、電針組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 4 組大鼠Zea-Longa 評分比較〔只（%）〕Table 3 Comparison of Zea-Longa scores among 4 groups of rats

2.2 4 組大鼠學習記憶能力比較 定位航行實驗的重復測量方差分析結果顯示，時間、組別主效應及時間與組別的交互效應。在治療第9～13 天逃避潛伏期比較差異有統計學意義（P＜0.05）。以組別為自變量的效應分析結果顯示，治療第9～13 天4 組大鼠逃避潛伏期比較差異有統計學意義（P＜0.05），第9～13 天模型組均大于假手術組（P＜0.05），電針組均低于模型組（P＜0.05），見表4。

表4 4 組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）Table 4 Comparison of incubation period among 4 groups of rats

表4 4 組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）Table 4 Comparison of incubation period among 4 groups of rats

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數 第9 天 第10 天 第11 天 第12 天 第13 天空白組 12 38.6±5.0 31.1±5.9 25.8±4.5 13.9±3.7 8.4±3.3假手術組 12 37.7±7.2 31.4±6.2 25.1±5.6 14.0±4.2 8.2±3.4模型組 12 51.9±6.3ab 42.4±6.0ab 34.5±5.0ab 27.5±5.1ab 20.7±5.9ab電針組 12 46.5±6.2c 37.6±5.1c 29.5±4.9c 20.4±3.3c 12.4±4.2c F 值 F交互=1.191，F組間=52.513，F時間=277.985 P 值 P交互=0.30，P組間＜0.05，P時間＜0.05

空間探索實驗結果表明，4 組大鼠穿越平臺有效區域次數比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中模型組穿越平臺有效區域次數低于空白組、假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 4 組大鼠穿越平臺有效區域次數比較（±s，次）Table 5 Comparison of times of crossing the effective region of the platform among 4 groups of rats

表5 4 組大鼠穿越平臺有效區域次數比較（±s，次）Table 5 Comparison of times of crossing the effective region of the platform among 4 groups of rats

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示假手術組比較P＜0.05，c表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數 穿越平臺次數空白組 12 7.99±2.71假手術組 12 7.64±3.20模型組 12 2.19±1.52ab電針組 12 4.87±1.65c F 值 15.57 P 值 ＜0.05

2.3 4 組大鼠腦梗死體積占比比較 空白組、假手術組、模型組、電針組大鼠腦梗死體積占比分別為0、0、（36.7±6.3）%、（24.0±2.2）%，電針組大鼠腦梗死體積占比低于模型組，差異有統計學意義（t=3.30，P＜0.05），4 組大鼠腦組織TTC 染色情況見圖1。

圖1 4 組大鼠腦組織TTC 染色Figure 1 TTC staining of brain tissue in 4 groups of rats

2.4 4 組大鼠海馬CA1 區神經元形態 空白組和假手術組CA1 區神經元排布緊致，胞質均勻、顏色均勻，核顯示清楚，形態規整；模型組神經元數目稀少，大小、形態各異，胞膜完整性差，部分變形、腫脹、破裂，胞質顏色偏深，分布不均，核深染固縮，核仁顯示不清；電針組神經元數目較模型組增多，排列較為密集規整，形態規則，膜和核仁清晰可見，胞質分布均勻，見圖2。

圖2 4 組大鼠海馬CA1 區HE 染色情況（×200）Figure 2 HE staining in hippocampal CA1 region of 4 groups

2.5 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較 4 組大鼠BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中模型組BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平低于空白組、假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），電針組BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 4組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of mRNA levels of BDNF，TrkB，PI3K and Akt in hippocampal tissues of four groups

表6 4組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of mRNA levels of BDNF，TrkB，PI3K and Akt in hippocampal tissues of four groups

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 例數 BDNF TrkB PI3K Akt空白組 3 1.00±0.09 1.00±0.02 1.00±0.12 1.00±0.20假手術組 3 0.99±0.04 1.00±0.02 1.03±0.10 1.00±0.10模型組 3 0.23±0.03ab 0.48±0.10ab 0.55±0.04ab 0.53±0.05ab電針組 3 0.76±0.08c 0.75±0.07c 0.88±0.16c 0.90±0.09c F 值 91.95 44.87 11.45 10.35 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平比較 空白組與假手術組BDNF、TrkB 蛋白水平及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平無差異（P＞0.05）；與假手術組相比，模型組BDNF、TrkB 蛋白水平均下降（P＜0.01；P＜0.001），PI3K、Akt蛋白磷酸化水平下降（P＜0.01；P＜0.05）；與模型組相比，電針組BDNF、TrkB 蛋白水平和PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表7、圖3。

圖3 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白質印跡法蛋白條帶圖Figure 3 Protein bands of BDNF，TrkB，PI3K，Akt，p-PI3K，p-Akt in the hippocampus of the four groups of rats by Western Blotting

表7 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達水平比較（±s）Table 7 Comparison of protein relative expression levels of BDNF，TrkB，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in hippocampal tissues of four groups

表7 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達水平比較（±s）Table 7 Comparison of protein relative expression levels of BDNF，TrkB，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in hippocampal tissues of four groups

注：p-PI3K=磷酸化磷脂酰肌醇3激酶，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數 BDNF TrkB p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt空白組 3 0.32±0.07 0.95±0.04 0.58±0.01 0.33±0.03假手術組 3 0.32±0.07 0.91±0.06 0.59±0.04 0.35±0.03模型組 3 0.08±0.03ab 0.43±0.02ab 0.31±0.10ab 0.17±0.02ab電針組 3 0.23±0.07c 0.65±0.06c 0.54±0.09c 0.32±0.09c F 值 10.58 45.22 10.66 7.62 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

腦卒中后認知功能障礙歸屬于中醫學“呆病”“健忘”等范疇。現代醫家認為本病病位在腦，病機為腦脈痹阻、腦髓失養。患者因邪致氣血不暢，痰瘀閉阻清竅，腦髓不充而神識不清，表現為表情呆滯、學習記憶力下降等［15］。本研究團隊基于該病“病位在腦，首取督脈”的學術思想，在前期文獻研究的基礎上，總結出以電針神庭、百會為主的通督醒神針刺療法，在臨床應用廣泛，療效顯著［5］。神庭為督脈、足太陽、陽明之會，對于神智方面的疾病，非神庭莫能治。百會位居巔頂，貫通周身經穴，是調節大腦功能的要穴。前期研究發現，電針神庭、百會能夠有效改善腦卒中后患者認知功能，提高生活自理能力［6-7］。

海馬與學習記憶、情緒等高級腦活動密切相關。正常情況下，短時記憶儲存在海馬中，大腦通過重復和強化后將部分短時記憶轉變為永久性記憶儲存在大腦中。而當各種原因導致海馬損傷時，機體則會出現不同程度的學習和記憶功能的障礙。因此，海馬常被用來研究與學習記憶有關的生理機制。其次，海馬神經元對缺血缺氧異常敏感，因此海馬也是研究最多的與腦卒中后學習記憶障礙有關的腦區［16-17］。本研究發現，MCAO/R 大鼠海馬CA1 區神經元廣泛溶解、數目稀少、細胞結構模糊不清，同時神經功能缺損評分及行為學觀察發現大鼠存在不同程度的學習記憶功能減退，與海馬神經元的損傷程度密切相關。

BDNF 作為哺乳動物中樞內分布最為廣泛、含量最高的營養因子，對神經元形成、功能重塑以及情緒、學習和記憶等功能的發揮具有重要作用［18-19］。BDNF 表達異常可導致神經元軸突和樹突的生長受限，影響突觸信號傳遞，進而導致神經系統疾病的發生，如神經退行性病變、神經疼痛、抑郁、癲癇等。同樣，海馬BDNF的表達差異與其結構和功能相關。有研究發現，敲除BDNF 基因可引起小鼠認知功能障礙，甚至導致小鼠死亡［20］。向大鼠腦室內注射BDNF 能夠預防缺血海馬CA1 區神經元死亡，促進DG 區顆粒細胞的生長與成熟，增強海馬突觸后受體活性，從而改善神經功能［21］。

BDNF 對中樞神經系統的調控作用是依賴于與其下游高親和力受體TrkB 結合后，TrkB 可發生二聚體化，繼而引發下游PI3K/Akt 信號通路的激活。BDNF/TrkB介導的PI3K/Akt 信號級聯反應在突觸重塑、神經元形成以及情緒、學習和記憶神經發育及相關疾病中發揮著重要作用。PI3K/Akt 信號通路是廣泛存在于細胞內重要的生存信號傳導通路之一，其激活與細胞增殖、分化密切相關。在神經系統損傷中起著非常重要的作用［22］。LI 等［23］采用甲叉丙烯酰胺干預局灶性腦缺血后大鼠模型，結果發現治療組大鼠海馬組織PI3K 信號通路被激活，同時水迷宮檢測發現大鼠認知功能提高，說明通過調控PI3K 信號通路可以改善腦缺血缺氧大鼠的認知能力。本研究結果顯示，MCAO/R 模型大鼠海馬BDNF、TrkB、PI3K、Akt 水平下降，學習記憶能力受損，神經元損傷明顯，而電針干預能夠提高BDNF、TrkB、PI3K、Akt 水平，改善學習記憶能力，這可能與電針提高該通路水平、增強海馬突觸可塑性有關，然而仍需要進一步研究驗證。此外，mTOR 作為PI3K/Akt 通路的下游關鍵蛋白，是自噬的關鍵調節劑，那么電針療法是否是通過影響BDNF/TrkB 介導的PI3K/Akt/mTOR 信號級聯反應調控了海馬神經元的自噬水平而發揮作用的，以及自噬與突觸可塑性的關系如何仍有待后續進一步研究。

作者貢獻：蘇凱奇負責文章的構思設計及論文的撰寫；蘇凱奇、呂轉、羅萌、聶晨晨、劉昊負責動物實驗實施、數據收集整理；吳明莉、高靜負責實驗管理及數據分析；馮曉東負責文章的質量控制及終稿的審校，對論文負責。

本文無利益沖突。