聚多巴胺功能化大腸桿菌生物電催化劑的構建及其氧還原性能

白正宇,邢寶鳳,牛洋娣

(河南師范大學 化學化工學院,河南 新鄉 453007)

隨著化石能源造成的環境污染問題日益嚴重,探索和開發可再生及環境友好的新型替代能源技術成為研究領域的熱點［1-2］.微生物燃料電池(MFC)作為一種綠色可持續的新興生物電化學技術而備受關注［3-5］,其利用微生物細胞呼吸過程中復雜的氧化還原反應將化學能直接轉換為電能,在污水處理、生物修復和清潔電能生產方面展現了巨大的潛力［6-7］.氧還原反應(ORR)是發生在MFC陰極上的主要反應［8］.因此,研發高效率和低成本的ORR電催化劑是促進MFC進一步發展的關鍵.生物電催化劑具有綠色、高效和可再生的生物學特性,利用生物系統材料來催化MFC陰極上發生的氧還原反應對于可持續能源發展具有重要意義［9-11］.分離的氧化還原酶和電活性微生物細胞是兩種最常見和應用最廣泛的生物電催化劑.相對于氧化還原酶的易失活和易脆性,微生物細胞具有自我復制和自我修復的特性,增強了生物催化平臺的運行穩定性［9］.然而,電活性微生物自身的細胞膜導電性較差,這將導致微生物細胞之間的跨細胞膜界面以及微生物與電極之間的生物/非生物界面細胞外電子轉移(EET)速率緩慢,限制了微生物細胞的生物電催化活性和產電效率［12-15］.

對微生物細胞進行導電納米修飾,不僅能對細胞提供保護作用,增強其耐受性和穩定性,而且能提升它們的本征催化活性和導電性［16-17］,從而提高生物電催化ORR能力和MFC的整體性能.在微生物細胞表面涂覆多功能導電納米材料,可以改善活細胞的代謝或增強其對惡劣環境的抵抗力［18-19］.含有共軛雙鍵和離域π軌道的導電聚合物作為生物電極和生物系統之間的中介材料,可以與生物系統發生密切的相互作用,并且能增強細胞的穩定性,如在細胞表面原位合成的聚吡咯(PPy)“導電細胞壁”可以有效地加速EET,而不損害生物催化活性或產電效率,因此,MFC的電流或發電量可以大大增強.然而,一個被忽視的問題是,PPy的疏水性導致電活性細菌黏附性降低,增加了生物膜形成的難度.具有黏附性的導電納米材料可以直接影響內部細胞和外部環境之間的質量和能量交流,不僅能夠作為連接相鄰細胞的電子橋梁,同時賦予其良好的附著力,使功能化后的細胞密集附著在電極表面［20］.研究表明,多巴胺前體在電極表面沉積為多功能和強黏附膜的獨特特征是由于其分子結構中存在兒茶酚和胺基.聚多巴胺(PDA)和不同種類的生物分子之間的相互作用,如氫鍵、疏水相互作用和芳香-陽離子相互作用,已被用于促進各種物質的黏附,如蛋白質、核苷酸、低聚糖和脂類.另外,PDA具有豐富的官能團,例如氨基、酚羥基等親水基團,可以提高底物的親水性.PDA還具有大量的醌基,是氧化還原活性功能配體,進一步適用于加速細胞外呼吸過程中的電子轉移,改善細胞與電極之間的界面電子轉移［21-22］.此外,PDA具有優異的生物相容性,良好的黏附力,可以保護微生物細胞的生存能力［23］.

本文通過在單個大腸桿菌表面原位聚合得到PDA功能性涂層(E.colicell@PDA),可以改善生物/無機界面的電子轉移,并對其生物電催化能力進行評估.PDA功能性涂層的成功制備在不降低細菌細胞活力的情況下提高細菌細胞的導電性,EET效率顯著提高.電化學測試結果顯示,PDA功能性涂層可以提高大腸桿菌的ORR電催化活性,E.colicell@PDA在MFC中作為生物陰極,氧還原電流密度明顯提高,由天然大腸桿菌(nativeE.colicell)的2.13 mA·cm-2增加到2.62 mA·cm-2,最大輸出功率密度達到95.3 μW·cm-2,為功能化生物電催化劑的構建及性能調控提供了一種有效策略.

1 實驗部分

1.1 細菌培養

大腸桿菌在LB培養基(10.0 g·L-1胰蛋白胨、10.0 g·L-1NaCl、5.0 g·L-1酵母粉)中,在37 ℃的搖床(200 r·min-1)上復蘇7～8 h,再經過擴大培養7 h左右到達生長平臺期,通過離心(4 000 r·min-1,4 min)收集細菌沉淀以供進一步使用.

PDA涂層包覆大腸桿菌的過程:將收集到的細菌沉淀懸浮于10 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)中,加入10.0 mg的鹽酸多巴胺,在搖床上振蕩4 h(37 ℃,200 r·min-1),離心(6 000 r·min-1,4 min)獲得E.colicell@PDA的細菌沉淀.

1.2 生物電極的構建

將依次通過丙酮、無水乙醇和混酸(V(濃硫酸)∶V(濃硝酸)=3∶1)超聲處理、洗至中性并干燥過的碳布(2 cm×2 cm)放入被PDA包覆的大腸桿菌的LB培養基懸浮液中,在搖床上(37 ℃,200 r·min-1)搖36 h左右,使細菌牢固地附著在碳布上.為了進行比較,天然大腸桿菌的電極也按照同樣的步驟制備.

1.3 材料表征

細菌懸浮液用超純水洗滌3次,接著在戊二醛中固定8 h左右,離心,再用超純水洗滌3次,然后依次用不同體積濃度的乙醇(體積分數分別為30%、50%、70%、85%、90%、100%)梯度洗脫,每個體積濃度洗脫3次,每次持續10 min.利用SU8010掃描電子顯微鏡(SEM)觀察制備的生物電催化劑的表面形貌,JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(TEM)觀察生物電催化劑的內部結構.利用LabRAM HR Evolution高分辨拉曼光譜儀和NEXUS紅外光譜儀進行結構測試,利用P200/P200+紫外可見分光光度計對物質的組成進行測定和分析.

1.4 細菌活力測試

使用LIVE/DEAD染色細菌活力試劑盒對細胞活力進行檢測.按照產品說明書配制染色工作液(V(NucGreen)∶V(EthD-Ⅲ)=1∶2),將細菌懸液稀釋到合適的體積濃度,取1 mL細菌懸液,加入10 μL的染色工作液,充分混合,室溫避光孵育15 min,之后取10 μL細菌懸液滴在帶有蓋玻片的載玻片上,使用FV1200MOE激光共聚焦顯微鏡進行拍照.

1.5 微生物燃料電池的組成

采用雙室MFC(內腔容積50 mL),由質子交換膜Nafion117膜隔開,陽極為40%Pt/C|CC,陰極為E.colicell@PDA|CC或nativeE.colicell|CC.陽極室中加入含1 mol·L-1葡萄糖的10×PBS緩沖溶液(7.518 0 g Na2HPO4·12H2O,1.496 0 g KH2PO4,2.480 0 g NaCl,0.060 0 g MgSO4,0.005 6 g CaCl2),通入氮氣,陰極室中加入含4 g·L-1葡萄糖的10×PBS緩沖溶液,2 mL的LB培養基和適量菌液,通入氧氣.MFC的外電阻均為1 000 Ω,均在37 ℃下操作.每次測試都要準備3個獨立的MFC.

陽極的制備過程為:稱取0.004 6 g的40%(質量分數)鉑碳分散于2 mL異丙醇中,超聲混勻,接著加入293 μL Nafion溶液繼續超聲均勻.用微量注射器分多次移取上述400 μL分散液涂至預先處理好的碳布上,在室溫下晾干即可.

1.6 電化學測試

使用上海辰華CHI760E電化學工作站,37 ℃下采用標準三電極體系(對電極為鉑片電極,參比電極為銀/氯化銀電極,工作電極為負載細菌的碳布電極),在氧氣或氮氣飽和的M9溶液中進行ORR電化學測試.循環伏安法(CV)和線性掃描伏安法(LSV)均在-0.6～0.3 V電壓之間進行測試.

電極的制備過程為:將天然的大腸桿菌或PDA包覆的大腸桿菌懸浮于50 mL的LB培養基中,加入預先處理好的碳布,置于搖床(37 ℃,200 r·min-1)中振蕩36 h,此時細菌已經附著碳布上,將碳布取出,室溫下晾干,即為所制備的工作電極.

2 結果與討論

PDA功能性涂層是在單個細菌表面通過多巴胺單體原位氧化聚合得到,經過優化聚合時間,在大腸桿菌表面形成均勻的PDA納米殼層.通過掃描電子顯微鏡和超薄切片的透射電子顯微鏡測試可以觀察到PDA納米涂層包覆前后的細菌表面的形態變化(如圖1所示).從掃描電子顯微鏡(SEM)圖(圖1a)可以看出,天然的大腸桿菌細胞由于脫水表面出現褶皺,但整體表面相對光滑.而經過PDA功能涂層包覆的大腸桿菌細胞更加圓潤(圖1d),這歸因于PDA涂層對細胞的保護作用,此外,可以明顯看到包覆后細胞表面比較粗糙,布滿了納米顆粒.通過切片的透射電子顯微鏡(TEM)圖(圖1b)和切片TEM圖的局部放大圖(圖1c)可觀察到大腸桿菌細胞表面相對光滑,細胞的內膜和外膜可以清晰看到。由PDA功能涂層包覆后的大腸桿菌細胞切片的透射電子顯微鏡(TEM)圖(圖1e)和其局部放大圖(圖1f)可清晰地看到,PDA納米顆粒與細菌細胞外膜緊密連接并均勻包裹在細胞膜上,證明了在大腸桿菌細胞表面成功形成了PDA納米顆粒.另外,PDA納米顆粒具有豐富的活性官能團,易與材料表面共價交聯,有希望連接細菌的電子導管,可以改善生物/電極界面間的電子轉移［24］.

為進一步確定細菌表面形成的聚合物涂層的組成結構,對其進行了光譜分析.首先利用拉曼光譜(圖2a)分析PDA涂層的分子結構,在單純的PDA聚合物的拉曼光譜中,1 338 cm-1和1 414 cm-1的吸收峰歸屬于C=O鍵的特征峰,1 583 cm-1的吸收峰歸屬于芳烴C=C鍵的特征峰［25］,這些特征峰在PDA包覆的大腸桿菌細胞(E.colicell@PDA)的拉曼光譜中均存在,而在天然的大腸桿菌細胞(NativeE.colicell)的拉曼光譜中未觀察到PDA的特征峰,同時,在1 100 cm-1處的特征峰是大腸桿菌自身的特征峰,這些結果表明PDA聚合物成功包覆在大腸桿菌細胞表面.另外,由UV-vis光譜(圖2b)可看出大腸桿菌自身沒有明顯的吸收峰,而合成的純PDA納米顆粒與PDA包覆的大腸桿菌都有一個強烈的吸收峰(279 nm)該吸收峰歸因于PDA的特征峰,證實了PDA涂層在大腸桿菌細胞上的存在.通過傅里葉變換紅外光譜(圖2c)對形成的聚合物涂層做進一步的分析,在1 118 cm-1和1 285 cm-1處的吸收峰歸因于PDA的C-O鍵的伸縮振動［26-27］,這些吸收峰在天然的大腸桿菌中均未發現,這些結果都證明了PDA成功地包覆在大腸桿菌表面.

為了探討PDA納米涂層對細菌細胞生存活力的影響,通過LIVE/DEAD染色細菌活力試劑盒對細胞染色,進行共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)的分析,發現經過PDA修飾的細菌細胞表現出強烈的綠色熒光和較弱的紅色熒光(圖2e),與天然的大腸桿菌相似(圖2d),說明包覆前后均具有較高的活細胞比例.因此PDA涂層對大腸桿菌的活力幾乎沒有影響.接著通過UV-vis光譜分析比較了天然的大腸桿菌和PDA包覆的大腸桿菌在LB培養基中在600 nm處的光學密度(OD600),來進一步監測細胞的生長情況(圖2f),從圖2f中可看出PDA包覆的大腸桿菌的孵育時間后進入了與天然細胞相似的繁殖階段,說明PDA納米涂層對大腸桿菌細胞的自分裂性能幾乎沒有影響,具有良好的生物相容性［28］.

為了進一步探究PDA納米涂層對大腸桿菌ORR電催化活性功能的促進作用,在PDA成功包覆大腸桿菌表面后,通過使用三電極電化學測試系統對功能化的大腸桿菌進行半電池電化學分析,結果表明與天然的大腸桿菌相比,E.colicell@PDA具有更高的電催化ORR活性,這歸因于其顯著增強了直接電子轉移能力,以及電極上更密集的細菌附著量.為了證明E.colicell@PDA的電催化活性,在氧氣或氮氣飽和的M9溶液中進行循環伏安(CV)測試.圖3a顯示,在氧氣飽和的M9溶液中進行CV測試時,掃描速率為50 mV·s-1,不同的大腸桿菌均在0.35 V vs.RHE有一個明顯的陰極還原峰,與天然的大腸桿菌(2.13 mA·cm-2)相比,E.colicell@PDA的還原電流(2.62 mA·cm-2)增加了約23 %.通過線性掃描(LSV)測試(圖3b)結果可看出,E.colicell@PDA生物催化劑的極限電流密度比天然的大腸桿菌增加了約0.1 mA·cm-2,這些結果表明E.colicell@PDA有更好的ORR催化活性,歸因于PDA具有良好的導電性以及豐富的活性官能團,產生了更多的催化活性位點,有助于大腸桿菌催化活性的提高.為了探究生物-非生物界面的電荷轉移電阻,進行了電化學阻抗譜(EIS)分析測試,對比兩種生物催化劑的Nyquist圖(圖3c)可以發現,E.colicell@PDA的電阻要小于天然的大腸桿菌,進一步證明了PDA功能性涂層的修飾顯著提高了細胞與電極間的電子轉移效率.在氮氣飽和的M9溶液中進行CV測試時,天然的大腸桿菌在約0.19 V和0.30 V(vs.RHE)處有一對明顯的氧化還原峰(圖3d),這是由于大腸桿菌中的催化活性蛋白細胞色素c(Cyt c)通過Fe3+和Fe2+之間的電子轉移增強細胞的氧化還原活性.而E.colicell@PDA的氧化還原峰更加明顯,說明具有更強的直接電子轉移能力以及電化學氧化還原活性.在氮氣飽和的M9溶液中,以0.01到1.00 V·s-1的不同掃描速率來記錄氧化還原峰值電流(圖3e).根據峰值電流與掃描速率的對應關系(圖3f),發現峰值電流隨掃描速率的增加呈線性增加,表明E.colicell@PDA的電催化ORR過程為表面控制過程.

為了評估不同細菌的生物發電能力,構建了雙室微生物燃料電池(MFC).當MFC電壓輸出穩定時,在陰極和陽極之間連接不同的外部負載,得到功率密度曲線(圖4a)和電流-電壓(I-V)的極化曲線(圖4b).結果表明,采用天然的大腸桿菌作為生物陰極的MFC的最大輸出功率密度為44.5 μW·cm-2,E.colicell@PDA生物陰極的MFC的最大輸出功率密度為95.3 μW·cm-2,其產電性能遠高于天然的大腸桿菌,進一步說明E.colicell@PDA的電催化還原能力更好.從極化曲線可以看出,采用E.colicell@PDA的MFC比天然的大腸桿菌的MFC的極化曲線的斜率更小,說明其內阻較小,有利于細菌與電極之間的電子轉移.對這兩種類型的MFC進行電化學阻抗譜(EIS)測試,EIS的Nyquist圖如圖4c所示,可以看出E.colicell@PDA生物陰極的電荷轉移電阻明顯低于天然的大腸桿菌,表明PDA的修飾提高了MFC的電荷轉移速率,大大降低了MFC的電荷轉移電阻.

為了證明PDA功能性涂層的黏附性,通過SEM圖對細菌在碳布電極上的附著情況進行了分析.可以觀察到天然的大腸桿菌在光滑的碳布纖維上附著量相對較少(圖5a),而E.colicell@PDA在光滑的碳布纖維上形成了致密的生物膜(圖5b),結果表明PDA具有良好的黏附力,使細菌更大程度附著在電極上,從而改善了MFC的產電性能.

3 結 論

氧化還原活性的聚多巴胺通過原位聚合包覆在單個大腸桿菌細胞表面,在不影響細菌細胞活力的情況下增強了ORR電催化活性以及最大輸出功率密度.PDA功能性涂層的引入不僅促進了細胞的生物電催化活性,而且PDA具有許多親水基官能團,增強了細胞的黏附性,與細胞膜緊密接觸并均勻包裹在細胞表面,增強了細胞外電子轉移速率.本文研究為制備高活性生物電催化材料提供了一種方法,有利于促進新型生物電催化劑的設計合成與性能探索.