益生菌聯合海藻多糖對草莓生長與品質的影響

于金慧，劉炳福，劉超，3，馬德源，4，馬云飛，陳高，韓福文，尤升波，畢玉平，3

(1.山東省農業科學院農作物種質資源研究所，山東濟南 250100；2.山東省農業科學院休閑農業研究所，山東 濟南 250100；3.山東師范大學生命科學學院，山東濟南 250014；4.山東省農業科學院黃河三角洲現代農業研究院，山東 東營 257300；5.濟寧市糧食和物資儲備保障中心，山東 濟寧 272000)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)屬薔薇科草莓屬漿果類多年生草本植物，富含維生素、蘋果酸、礦物質等營養物質及多酚、黃酮、花青素等生物活性成分，因其果肉香氣濃郁、風味獨特而備受消費者青睞。 我國已成為世界草莓生產和消費第一大國[1]。 據國家統計局數據顯示:2011—2020年期間，我國草莓種植面積及產量整體均呈上升趨勢，種植面積由7.81 萬公頃增至13.16 萬公頃，產量由200.9 萬噸增至344.9 萬噸。 我國草莓表觀需求量由2014 年的248.5 萬噸增至2020 年的344.3 萬噸，年復合增長率為5.6%。 2020 年出口量達5 815.6 噸，出口金額為1 531.0 萬美元。 由此可見，草莓具有很高的經濟價值，大力發展草莓種植業是“農業增效、農民增收”的有效途徑之一。

隨著人們生活水平的不斷提高，消費者的食品質量安全意識逐步增強。 然而，在主要追求產量的目標下，化肥、農藥過度使用導致土壤養分不平衡、產品品質下降的問題普遍存在，嚴重制約著草莓種植業的有序、良性發展。 海藻肥和微生物菌肥是應用較廣且具有多重優勢的生物肥料，可調節土壤微生物群落、提升土壤肥力、提高植株抗逆力及改善產品品質等[2-5]。 研究表明，由海藻與酵母菌提取物制備的生物刺激劑可顯著提高番茄果實大小和產量并改善其品質[6]，海藻肥與微生物菌劑聯用可替代10%～30%的化肥[7]，而EM菌發酵的海藻肥可顯著提高水稻的株高和分蘗數[8]，可見二者聯合具有很好的應用潛力。 然而，目前尚未見益生菌與海藻多糖聯合應用于草莓肥效的研究報道，關于二者聯用對草莓生長及果實品質的影響還未可知。 基于以上問題，本研究以實驗室分離篩選的功能乳酸菌為主，分別制備益生菌發酵液和海藻多糖發酵液，比較海藻多糖、益生菌發酵液、益生菌發酵液復配海藻多糖及海藻多糖發酵液對草莓植株生長、葉片生理特性和果實營養活性成分等指標的影響，并對處理后的土壤微生物多樣性進行初步分析，以期為研發提升草莓綜合品質的新型生物肥料提供技術支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試乳酸菌為本實驗室自行分離的菌種，包括植物乳桿菌DY-1(Lactiplantibacillus plantarumDY-1)、嗜酸乳桿菌KDB-03(Lactibacillus acidophilusKDB-03)、發酵乳桿菌KDB-08(Limosilactobacillus fermentum KDB-08)。 海藻多糖購自青島海大生物集團有限公司，純度為45%。 供試草莓品種為天仙醉和越秀。

1.1.1 培養基的制備 MRS 培養基:牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蛋白胨10.0 g，固體培養基另加瓊脂粉18.0 g，蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

發酵培養基:蛋白胨2.0 g、酵母粉2.0 g、紅糖60.0 g(海藻多糖250.0 g)，蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

1.1.2 益生菌發酵液的制備 將-80℃保藏的乳酸菌在MRS 平板上劃線，35℃培養48 h，挑取單菌落繼代培養2 次后，轉接至液體培養基，作為種子液。 在含和不含海藻多糖的發酵培養基中接種以上乳酸菌種子液，接種密度為1%，置于35℃發酵箱中發酵24 h 后備用。 發酵液中乳酸菌數量＞108CFU/mL。

1.2 試驗設計

試驗于2021 年11 月中旬至2022 年2 月在山東省農業科學院濟陽基地(36°58′34″N，116°59′01″E)溫室大棚內進行。 栽培草莓土壤為基質土＋當地農田土，試驗期間供試大棚內草莓統一肥水管理。

采用隨機區組設計，共設置5 個施肥處理(表1)，分別為清水對照(A)、海藻多糖(B)、益生菌發酵液(C)、海藻多糖＋益生菌發酵液復配(D)和海藻多糖發酵液(E)。 重復5 次，每重復10 株。 采用澆灌方式施肥，約兩周沖施一次。 試驗周期自11 月中旬至次年2 月上旬，各處理澆灌量按照每公頃15 kg 計算實際用量。

表1 試驗施肥處理方式

1.3 樣品采集

于草莓盛果期(2 月上旬)采集草莓植株及其果實、葉片樣品，每重復隨機選取5 棵植株混合采樣。 果實樣品隨機采集，每重復10 顆。 葉片樣品采集從植株內向外數第3 ～5 片展開葉，每重復6片。 樣品采集后快速放入低溫保存盒并帶回實驗室，果實稱重后液氮速凍；葉片分別用自來水和去離子水清洗6 次，用紙巾拭干后液氮速凍；速凍后的樣品置于-20℃冰箱并盡快測定相關指標。 土壤樣品采自于不同處理組的植株周邊距地表5 cm 以下土層，多點均勻采集，去除殘葉、石子等，快速放入低溫保存盒并帶回實驗室后直接寄送至青島擎科生物技術有限公司。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 植株生長性狀指標 草莓植株葉片、株高、根莖、冠徑(南北、東西)、葉片長寬、花萼直徑、果重等指標以統一標準進行測定。

1.4.2 植株葉片生理指標 葉片葉綠素含量參考文獻[9]、丙二醛含量參考文獻[10]的方法測定。

1.4.3 果實品質指標 可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定[11]，可溶性固形物含量參考NYT2637—2014 的方法測定，可滴定酸含量參考GB 5009.239—2016 中的酚酞指示劑法測定。 糖酸比為可溶性固形物與可滴定酸的比值。 VC 含量參考GB 5009.86—2016 中抗壞血酸檢測的方法測定，總花青素含量采用pH 示差法測定[12]，總酚含量采用Folin-Ciocalteu 法測定，總黃酮含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[13]測定。

1.4.4 土壤微生物多樣性分析 提取天仙醉草莓土壤DNA 并建庫，在IlluminaHiSeq 平臺測序，使用Trimmomatic 對原始數據進行質量過濾，然后使用Cutadapt 進行引物序列的識別與去除，其后使用USEARCH 對雙端reads 進行拼接并去除嵌合體，最終得到高質量序列用于后續分析。 使用USEARCH 在相似性97%水平上對序列進行聚類，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTUs。 利用Mothur 進行Alpha 指數分析，基于R語言平臺進行Beta 多樣性分析。 組間的物種豐度數據采用Metastats 分析。

1.5 數據處理與分析

試驗數據均為平均值±標準差，其中植株表型數據各處理8～10 個，其他數據均為3 次重復。采用Microsoft Excel 2019 整理數據及繪圖，采用SPSS Statistics 16.0 進行統計分析。 不同處理間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan’s 法(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對草莓植株生長及果實表型的影響

試驗結果表明，施肥前期兩品種草莓不同處理間的表型指標相當。 從生長狀態來看，施肥期間表現出較好的生長態勢，進入盛果期后，部分生長指標略有下降。 施肥末期，各施肥處理的葉片數(管理期間會定期打掉外周狀態不好的葉片)、根徑、冠幅、葉片大小等總體上較對照有明顯提升(表2)。

表2 施肥末期草莓植株生長表型

不同施肥處理對草莓果實表型有明顯影響(圖1A、B)。 由圖1C、D 可以看出，兩品種的單果重對各施肥處理的響應有顯著差異，其中天仙醉以海藻多糖發酵液處理效果最佳，較對照提高57.2%；而越秀以益生菌發酵液復配海藻多糖處理效果最佳，較對照提高40.3%。 兩品種單純海藻多糖處理的單果重與對照均無顯著差異。

圖1 不同施肥處理下兩品種草莓果實形態及單果重

2.2 不同施肥處理對草莓植株葉片生理指標的影響

由圖2 可以看出，與對照相比，施肥后兩品種葉片丙二醛含量均有不同程度降低，而葉綠素含量則均有不同程度增加，說明不同施肥處理均可增強植株的抗氧化水平，且能促進植株生長。 但是，不同品種葉片中的丙二醛和葉綠素含量對各處理的響應略有不同，其中天仙醉以海藻多糖發酵液處理的葉片丙二醛含量最低，越秀以益生菌發酵液處理的最低，均顯著低于對照，降幅分別為51.04%和39.75%。 天仙醉各處理的葉綠素含量均顯著高于對照，而越秀各處理的葉綠素含量較對照雖有增加但差異均不顯著。

圖2 不同施肥處理下兩品種草莓葉片丙二醛和葉綠素含量

2.3 不同施肥處理對草莓果實營養功能成分的影響

不同施肥處理均可提高草莓果實中可溶性蛋白含量(圖3A)，其中益生菌發酵液和海藻多糖發酵液處理可顯著提高天仙醉果實的可溶性蛋白含量，分別較對照提高72.9%和88.4%，而越秀各處理果實中可溶性蛋白含量差異不顯著，但顯著高于天仙醉(益生菌發酵液復配海藻多糖處理除外)。 對天仙醉而言，益生菌發酵液處理可滴定酸含量最高，各施肥處理均顯著提高其可溶性固形物含量，糖酸比則以益生菌發酵液復配海藻多糖最高，較對照顯著提高27.6%；對越秀而言，各施肥處理顯著降低可滴定酸含量，對可溶性固形物含量影響不顯著，但提高糖酸比值，其中益生菌發酵液復配海藻多糖增幅最高，達71.9%(圖3B～D)。

圖3 不同施肥處理兩品種草莓營養成分含量

從表3 看出，不同施肥處理對天仙醉活性成分含量影響較大，其中海藻多糖顯著增加果實中花青素和總黃酮含量，較對照分別提高9.94%和18.32%；益生菌發酵液顯著增加果實中VC、花青素和總黃酮的含量，較對照分別提高13.95%、36.56%和21.17%；益生菌發酵液復配海藻多糖顯著增加果實中VC、總酚和總黃酮含量，較對照分別提高21.57%、15.02%和23.70%；而海藻多糖發酵液僅顯著提高果實VC 含量，且花青素和總黃酮含量顯著降低。 相對而言，越秀果實中的活性成分含量多數顯著高于天仙醉，且各施肥處理對其影響大多不顯著。

表3 不同施肥處理草莓果實中活性成分含量 (mg/kgFW)

2.4 不同施肥處理對草莓種植土壤微生物多樣性的影響

從以上指標來看，不同草莓品種對施肥處理的響應差異較大，其中天仙醉的施肥效果較佳。因此，對天仙醉不同施肥處理的土壤微生物多樣性進行分析，進一步明確其發揮作用的相關機理。由圖4A、B 可見，不同處理之間微生物組成有明顯差異。 5 個樣本共檢測出2 013 個OTUs，不同組間共有44 個OTUs，特有數量各異(圖4C)，經統計分屬32 個門，75 個綱，190 個目，331 個科和557 個屬。從微生物所在目水平看，對照組和海藻多糖組的物種豐度相對較低，而含有益生菌的3 個處理組相對較高(圖4D)。 含益生菌的施肥處理均可顯著增加土壤微生物Shanpon 指數(圖5A)、Simpson 指數(圖5B)、Chao1 指數(圖5C)和PDwhole-tree 指數(圖5D)。 其中，益生菌發酵液組及益生菌發酵液復配海藻多糖組對土壤微生物α多樣性的改善效果最佳，海藻多糖發酵液組次之。

圖4 不同施肥處理下草莓土壤的微生物多樣性分析

圖5 不同施肥處理下土壤Alpha 多樣性指數

3 討論

微生物菌劑和海藻肥具有種類繁多、施用方式多樣化等特點[14，15]，二者在改良土壤、促進作物生長發育、增強植株抗逆性、改善產品品質等方面的作用已被得到廣泛認可。 盡管部分海藻肥生產過程中需要褐藻膠降解菌的參與，且部分產品復配了微生物菌劑，然而鑒于二者各自的特點，微生物菌劑與海藻肥聯合使用的方式、功效等仍是綠色農業生產過程中亟待解決的問題。 本研究選用的菌劑為實驗室自行分離的功能菌株發酵液和提取自滸苔的海藻多糖(純度45%)，聯合方式包括復配和直接發酵。 試驗結果表明，不同施肥處理均可在一定程度上提高單果重，這與前人研究結果一致[16，17]。 其中天仙醉以海藻多糖發酵液處理最佳，而越秀以二者復配效果最佳。 本研究中單用海藻多糖效果不佳，可能與施用濃度及方式等因素有關[14]，還需在生產實踐中進一步摸索最佳施用方式。

海藻肥富含多糖、多酚等活性物質以及有機質、大量和微量元素，可激活土壤中各類有益菌，改善土壤微生物結構和多樣性，間接影響植株對營養成分的攝取；所含的生長素、細胞分裂素、甜菜堿等生長調節物質能直接調控植株生理狀態[14]。 微生物菌劑中的各種微生物還可以改善植物根際土壤性質，增加土壤有機質含量和根際有益微生物數量，這些根際微生物通過固定氮元素、溶解磷元素、分泌抗生素與植物激素等物質而發揮積極作用[3]。 此外發酵液本身也富含糖、蛋白質、氨基酸、有機酸及抑菌物質和酶類[18]，均利于植株生長發育。 丙二醛是膜脂過氧化作用的產物之一，能夠反映植株抗氧化潛力，而葉綠素主要負責光能的捕獲、吸收、傳遞和轉化，葉綠素含量降低不利于葉綠體發育，可導致葉色發黃、光合效率降低、生長遲緩等。 本研究結果表明，海藻多糖和益生菌發酵液均可不同程度地促進植株生長，降低葉片中丙二醛含量，提高葉綠素含量，這與前人研究結果一致[2]。 兩品種均以益生菌發酵液處理效果最佳，海藻多糖及其與益生菌不同形式聯合處理效果相當。 然而，益生菌及二者復配處理組的土壤微生物多樣性改善情況顯著優于海藻多糖。 可見，微生物多樣性的改善僅是不同施肥處理發揮作用的原因之一，可能還涉及其他相關機制。

果實品質作為主要經濟性狀之一，當前在人們對品質要求越來越高的情況下其重要性更加突出，尤其是內在品質。 草莓的內在品質不僅局限于蛋白質、糖、酸含量及糖酸比等，還包括酚類、黃酮等生物活性成分[19，20]。 姜潔等[16]的研究表明，海藻肥可顯著增加草莓中的可溶性固形物、總糖、總酸含量，提高糖酸比，但是對抗壞血酸、總酚等抗氧化物質的影響較小。 Rahman 等[21]的研究表明，益生菌菌劑可有效提高果實中酚類、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素含量。 本研究中，不同施肥處理明顯提高兩種草莓的可溶性蛋白含量和糖酸比值，顯著降低越秀的可滴定酸含量，其中益生菌發酵液提高可溶性蛋白的效果最佳，而益生菌發酵液復配海藻多糖則更有利于增加糖酸比值。 與越秀相比，天仙醉的VC、花青素和總黃酮含量較低，但是對不同施肥處理的響應較強，其中以益生菌發酵液復配海藻多糖處理提升幅度最高，說明即便是同種作物但不同品種之間對肥料養分的需求和響應也存在差異。 這與前人的研究結果一致[22]，但是因品種差異導致的內在響應機制較為復雜，還需通過后續研究進一步明確。

此外，微生物發酵過程涉及生物轉化[23]，海藻發酵后的營養和活性物質會發生顯著變化[24]。Prasedya 等[8]的研究表明，EM 菌發酵海藻肥可顯著改善土壤微生物多樣性，提高水稻株高和分蘗數，但是未對籽實品質進行評價。 Mannino 等[6]研究采用的是海藻與酵母菌提取物制備的商業化生物刺激劑，該制劑可顯著改善番茄果實品質。本研究對比分析了益生菌發酵液復配海藻多糖和海藻多糖直接發酵兩種方式，從植株生長、單果重、葉片生理和果實營養等指標來看，兩種方式均表現良好，但是直接發酵型肥料顯著降低天仙醉的花青素、總酚和總黃酮含量，推測這可能與海藻多糖經益生菌發酵后形成的物質參與果實次生代謝活動所致，但是海藻多糖發酵后具體成分的變化情況及影響果實次生代謝的作用機制也需進一步探究。

4 結論

益生菌發酵液及其與海藻多糖聯合施用對提高草莓綜合品質具有協同增效作用，尤其是對天仙醉而言，不僅促進植株生長、顯著改善果實品相，還顯著提高果實營養和活性成分含量，這可能與土壤微生物結構的改善有關。 考慮到草莓品種的差異及肥料的最佳作用濃度、劑量和施用方式，還需通過后續試驗進一步相關數據優化以期研發效果最佳的新型生物肥及提供更加科學的施肥方案。 此外，益生菌發酵液及其與海藻多糖協同作用機制也有待于進一步深入探究。