3 種常見金銀花致病菌多重實時熒光定量PCR 檢測方法研究

朱桐杉，劉艷艷，譚晴晴，劉國霞，陳雪燕，步迅，王文博，于子涵，4，張全芳，張永清

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省農業科學院農作物種質資源研究所，山東 濟南 250100；3.山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，山東濟南 250100；4.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250013)

金銀花又名忍冬花，是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花[1]，在我國分布廣泛。 主要有效成分為黃酮類[2]、環烯醚萜類[3]、揮發油類[4]、酚酸類等[5]。其在醫藥領域中的應用非常廣泛，具有清熱解毒、通經活絡、消炎消腫之功效[6]。

隨著金銀花種植年限的增長，病蟲害也逐漸加重，以葉部病害和根部病害為主。 其中炭疽病、褐斑病和白粉病是最常發生的葉部病害，褐斑病可導致葉片枯萎脫落；金銀花植株感染白粉病會導致花蕾發育畸形，嚴重時會大量落花；炭疽病侵染莖枝時會使枝條倒伏、枯死，影響植株生長發育，降低花蕾的產量與品質[7]。 目前對于金銀花病害的檢測手段較少。 傳統的病原菌鑒定方法通常為病原菌分離后經過柯赫氏法則結合分子生物學進行鑒定[8]，該過程耗時長，容易延誤病害防治時機。 做好金銀花病害的早期檢測、及時開展防治工作，有效降低化學農藥施用量，對于保證金銀花藥材產量和質量具有重要意義。 因此建立一種快速、準確檢測金銀花炭疽病、褐斑病及白粉病病原菌的方法，并應用于3 種病害的早期防治是當務之急。

前期在山東省臨沂市平邑縣金銀花主產區發現并分離出炭疽病病原菌膠胞桿菌(Colletotrichum gloeosporioides)，并驗證了病原菌的致病性[9]，結合已報道的金銀花主要葉部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)和白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)，基于ITS 序列分別設計了特異引物和TaqMan 探針，通過優化PCR 體系和反應條件建立了多重實時熒光PCR 檢測體系，實現了金銀花炭疽病、褐斑病和白粉病病原菌的快速、準確和高通量檢測，以期為及時有效地防治金銀花葉部病害提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)、炭疽病病原菌膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、白絹病病原菌(Selerotium rolfsii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、金銀花葉斑病病原菌(Stemphyliumsp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)，保存于山東省農業科學院農作物種質資源研究所；用于驗證試驗的金銀花病害樣本采集于山東中醫藥大學藥用植物園和山東省臨沂市平邑縣金銀花產區。

高效植物基因組DNA 提取試劑盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，DNA 分子量Maker DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]，真菌基因組DNA 提取試劑盒(Axygen)，電泳上樣緩沖液[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 儀器與設備

Quant Studio7Flex 熒光定量PCR 儀(美國ABI)；Takara PCR 儀[寶生物工程(大連)有限公司]；Nano Drop Lite 超微量核酸檢測儀(賽默飛世爾)； 5424D 型高速離心機(Eppendorf 公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad 公司)；UV3600 紫外可見分光光度計(日本島津公司)。 引物和探針序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 使用Quant StudioTMReal-Time PCR Software 軟件進行繪圖。 使用Microsoft Excel 軟件進行表格制作。

1.3 試驗方法

1.3.1 3 種病原菌特異引物及TaqMan 探針設計根據GenBank 上的鼠李尾孢菌(Cercospora rhamni，GenBank 登錄號MT338042.1)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides， GenBank 登 錄 號MN833335.1)及白粉病病原菌(Erysiphe lonicera，GenBank 登錄號LC009992.1)序列，使用Primer premier 5.0 軟件分別設計引物對和TaqMan 探針。引物及探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.2 多重實時熒光PCR 體系構建 多重實時熒光PCR 反應體系(20 μL):2×TaqMan Master Mix 10 μL，炭疽病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，白粉病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，褐斑病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，DNA模板1 μL。 褐斑病引物和探針的終濃度分別為0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，白粉病引物和探針的終濃度為0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，炭疽病病原菌引物和探針的終濃度為0.25 μmol/L 和0.10 μmol/L。

多重實時熒光PCR 擴增條件:95℃2 min；95℃10 s，60℃35 s(在此階段收集熒光信號)，40個循環。

1.3.3 重組質粒的構建 使用1.3.1 中金銀花褐斑病、白粉病及炭疽病病原菌特異引物進行基因擴增，參考李敏[10]的方法進行重組質粒構建，對重組質粒PCR 產物進行測序，驗證是否正確插入目的片段。 DNA 測序在山東省農業科學院農作物種質資源研究所進行。

1.3.4 實時熒光PCR 標準曲線建立 使用UV3600紫外分光光度計測定3 種病原菌陽性重組質粒DNA 濃度，將重組質粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度稀釋成6 個濃度，每個梯度3 次重復。 反應體系與程序按照1.3.2 進行。根據重組質粒拷貝數初始量值和閾值循環數(Ct)進行多重實時熒光PCR 體系標準曲線的構建。

1.3.5 引物和探針特異性檢測 分別以膠孢炭疽菌、鼠李尾孢菌、白粉病病原菌、白絹病病原菌、木霉菌、禾谷鐮刀菌、金銀花葉斑病病原菌、黑曲霉的基因組DNA 為模板，按1.3.2 中多重實時熒光PCR 反應條件及反應體系進行檢測，每個樣本3 次重復，驗證引物和探針的特異性。

1.3.6 多重實時熒光PCR 方法靈敏度驗證 將重組質粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度依次稀釋8 個濃度，每個濃度重復3次，根據熒光信號值大小，評價相應引物和探針對3 種病原菌的檢測靈敏度。 同時以此DNA 模板和表1 中特異引物進行普通PCR 擴增，每個濃度重復2 次。

普通PCR 擴增體系:10×buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL、Taq酶(5 U)0.2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、DNA 模板(1～10 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 16.3 μL；擴增程序:95℃3 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30 個循環；72℃10 min。

1.3.7 驗證試驗 利用本研究建立的3 種病原菌多重實時熒光PCR 檢測方法對從臨沂市平邑縣金銀花產區、山東中醫藥大學藥用植物園采集的15 份葉部病害樣本進行檢測，同時提取樣本DNA、使用真菌通用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′，ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進行PCR 擴增，切膠回收并測序。 將兩種檢測方法的結果進行比較，以驗證本研究所建立的多重實時熒光PCR 方法的準確性與可行性。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR 標準曲線建立

以重組質粒拷貝數初始量值為橫坐標，Ct 值為縱坐標，得到褐斑病線性回歸方程為y ＝-3.296x＋40.234，R2＝0.998；白粉病線性回歸方程為y ＝-3.374x＋40.374，R2＝0.996；炭疽病線性回歸方程為y ＝-3.470x＋43.092，R2＝0.996(圖1)。3 種病原菌實時熒光PCR 標準曲線相關系數均大于0.99，擴增效率均接近100%，標準曲線橫縱坐標間形成良好線性關系，表明該方法具有效性。

圖1 3 種病原菌實時熒光PCR 標準曲線圖

2.2 引物和探針特異性驗證

按照1.3.5 方法進行特異性驗證，當ROX 熒光修飾探針有擴增曲線且滿足Ct≤35 時，說明待檢樣本檢出炭疽病病原菌；當FAM 熒光修飾探針有擴增曲線且滿足Ct≤35 時，說明待檢樣本檢出白粉病病原菌；當JOE 熒光修飾探針有擴增曲線且滿足Ct≤35 時，說明待檢樣本檢出褐斑病病原菌；當FAM、JOE 和ROX 熒光修飾探針均無擴增曲線時，表明該檢測樣品為陰性。 由表2 可知，本試驗建立的多重實時熒光定量PCR 方法只能特異擴增目的病原菌，對其他病原菌均無擴增，說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR 體系的引物及探針的特異性良好。

表2 引物及探針特異性驗證試驗

2.3 檢測靈敏度

多重實時熒光定量PCR 檢測方法和普通PCR 法對金銀花褐斑病、白粉病和炭疽病3 種病原菌靈敏度驗證結果見圖2A、B、C。 3 組重組質粒在濃度29.4 copies/μL 時，Ct 值＞35，因此多重實時熒光定量PCR 法對3 種病原菌檢測最低檢測限為2.94×102copies/μL；在普通PCR 擴增中，當模板DNA 濃度為2.94×104copies/μL 時有明顯擴增條帶，低于此濃度則無擴增條帶，因此普通PCR 法 檢 測 靈 敏 度 為2.94 × 104copies/μL(圖2D)。 結果表明，本試驗建立的多重實時熒光PCR 檢測方法的靈敏度比普通PCR 法高100倍。

圖2 3 種病原菌多重實時熒光定量PCR(A、B、C)和常規PCR(D)擴增體系靈敏度

2.4 驗證試驗

分別使用本試驗建立的檢測方法和DNA 測序法對實際樣本進行檢測，多重實時熒光定量PCR 結果檢測出炭疽病病原菌陽性樣本4 份、白粉病陽性樣本5 份、褐斑病陽性樣本6 份，檢出率為100%，與DNA 測序結果完全一致(表3)。

表3 實際樣本檢測結果

3 討論與結論

金銀花為山東道地藥材之首，主產于山東省臨沂市平邑縣。 以花入藥，藥用歷史悠久。 性味甘寒，氣味芳香，有清透疏表、清熱解毒之效。 亦可食用，具有一定的保健功能，老少皆宜。

傳統植物病原菌通常使用組織分離法結合DNA 測序法進行鑒定，如紫薯腐敗菌的分離和鑒定[11]、馬鈴薯赤霉病病原菌的分離和鑒定[12]等，耗費時間較長。 實時熒光定量PCR 法可實現數個樣品的自動化檢測，成本低，較普通PCR 技術所用時間短，能在病害初期進行快速檢測[13]。 目前已經建立了柑橘枯萎病病毒[14]、橄欖果實中敏感炭疽菌[15]等實時熒光定量PCR 檢測方法。

褐斑病、白粉病及炭疽病是常見的3 種金銀花葉部病害，也是導致金銀花減產、降質的重要原因。 感染白粉病時，葉部綠原酸含量降低[16]；褐斑病、炭疽病發病后期，斑點融合導致葉片呈現圓形或不規則病斑，嚴重時會導致全株葉片脫落、植株枯死[17，18]，且病害后期致病菌可停留在土壤及病殘體中越冬。 李志紅等[19]對封丘金銀花炭疽病染病植株葉片進行分離和檢測，得到炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；研究表明金銀花褐斑病病原菌為半知菌亞門鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、金銀花白粉病病原菌為Erysiphe lonicera[20，21]。

目前對3 種金銀花病害的研究還停留在發病癥狀調查和病原菌分離鑒定階段，防治措施是在葉部出現明顯癥狀后進行噴灑農藥或剪去帶病枝條[22，23]，而針對3 種病害的分子檢測方法還未見報道。 實時熒光定量PCR 技術具有操作簡便、快速高效、高通量、高敏感性等特點，在分子診斷、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面有廣泛應用，提高了檢測時效性和靈敏度。 多重實時熒光定量PCR 方法可在同一個檢測體系中對多個目標序列同時進行檢測，且能精確定量。 如利用實時熒光逆轉錄定量PCR 技術快速檢測香蕉的枯萎芽孢桿菌[24]、菊花的花葉白銹菌及褐銹菌[25]、馬鈴薯中常見瘡痂病及病原菌[26]以及檢測羊奶中牛奶和大豆源性成分[27]。

本研究基于ITS 序列設計引物與TaqMan 探針，建立了可同時檢測金銀花褐斑病、白粉病及炭疽病3 種病害病原菌的多重實時熒光PCR 檢測體系，該方法最低檢測限度為2.94×102copies/μL，比普通PCR 方法提高100 倍，特異性強，可為金銀花葉部病害早診斷、早防治提供技術支持，彌補了金銀花炭疽病、褐斑病及白粉病病害檢測方法的缺失。 但本試驗未曾對多種病害同時檢測進行實際樣本驗證，對于病原菌的鑒定停留在定性層面而未進行定量計算，因此關于多種病原菌的同時檢測及其定量分析是下一步研究重點。