溫陽振衰顆粒調控miR-155/p38MAPK途徑減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷機制研究

張 馳,李奧博,王心怡,王沛昕

(1.北京大學第三醫院,北京 100621;2.北京豐臺右安門醫院,北京 100069;3.北京豐臺醫院,北京 100071)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是指缺血心肌獲得血流再灌注后發生的損傷,常見于冠狀動脈旁路移植手術、急性心肌梗死介入手術等,可增加手術后再發心肌梗死、惡性心律失常、心源性猝死的風險[1]。因此,防治MIRI成為了心血管領域研究的熱點。近些年,中醫藥在心血管疾病治療中的價值受到越來越多關注,溫陽振衰顆粒是湖南中醫藥大學研發的中藥顆粒劑,由附子、干姜、甘草、紅參等組成,有扶陽破陰、逐寒救逆的功效,已經在慢性心衰、阿霉素誘導心肌損傷模型中被證實其能夠減輕心肌損傷,并且通過調控miR-155/p38MAPK通路發揮心肌保護作用[2-3]。但溫陽振衰顆粒在MIRI中的應用價值及作用機制尚不清楚。miR-155靶向抑制p38MAPK的作用已經在樹突狀細胞、神經細胞中被證實[4-5];而在腎臟、心肌等組織缺血再灌注的過程中,p38MAPK通路的激活介導了促炎因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的釋放,進而促進炎癥反應的級聯放大[6-7]。基于此,推測miR-155/p38MAPK軸可能在MIRI過程中起重要作用,能夠調控miR-155/p38MAPK軸的溫陽振衰顆粒可能在MIRI過程中起治療作用。故本研究建立大鼠MIRI模型,具體分析溫陽振衰顆粒調控miR-155/p38MAPK途徑減輕MIRI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:成年雄性SD大鼠64只,購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司,10～12周齡,體重200～250 g,生產許可證號:SCXK(滬)2017-0012。

1.1.2 實驗試劑:溫陽振衰顆粒由制附子、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草組成,購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院;miR-155抑制劑、模擬物及陰性對照序列購自上海吉瑪公司;磷酸肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自上海酶聯公司;miRNA提取及檢測試劑盒購自北京天根公司;蛋白裂解液購自北京索萊寶公司;p-p38MAPK一抗購自CST公司。

1.1.3 實驗儀器:多功能酶標儀購自美國Bio-tek公司;凝膠電泳系統及成像系統購自上海牧德如公司;熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及干預:①miR-155/p38MAPK通路在心肌MIRI損傷中的作用:32只大鼠隨機分為陰性對照組、陰性對照+MIRI組、miR-155抑制劑+MIRI組、miR-155模擬物+MIRI組,每組8只;四組大鼠予30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開胸腔,暴露心臟,分別在左心室前壁6個點給予陰性對照腺病毒、miR-155抑制劑腺病毒、miR-155模擬物腺病毒1×109PFU局部注射。4 d后造模,陰性對照組進行假手術操作,30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開胸腔,暴露心臟,分離左冠狀動脈前降支并穿線,但不結扎;其余各組均進行MIRI造模,30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開胸腔,暴露心臟,分離左冠狀動脈前降支并穿線,將1.5 mm乳膠管放置在縫線與冠脈之間,結扎縫線使心肌缺血30 min,而后取出乳膠管,使心肌再灌注12 h,然后收集心肌及血樣進行后續檢測。②溫陽振衰顆粒通過miR-155/p38MAPK途徑減輕心肌MIRI損傷:32只大鼠隨機分為對照組、MIRI組、中藥組、中藥+miR-155抑制劑組,每組8只。對照組和MIRI組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液灌胃,中藥組和中藥+miR-155抑制劑組給予2.88 g/(kg·d)溫陽振衰顆粒灌胃,連續灌胃14 d;中藥+miR-155抑制劑組在灌胃第10 d時予30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開胸腔,暴露心臟,在左心室前壁6個點給予miR-155抑制劑的腺病毒1×109PFU局部注射。末次灌胃后次日進行造模,對照組進行假手術操作,其余三組進行MIRI造模,收集心肌及血樣進行后續檢測。

1.2.2 血清心肌酶含量檢測:取血清樣本,采用ELISA試劑盒檢測CK-MB、LDH含量,按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 心肌miR-155表達水平檢測:取缺血再灌注部位的心肌組織適量,采用miRNA提取分離試劑盒提取組織樣本中的miRNA,而后將miRNA逆轉錄為對應的cDNA,最后采用miRNA熒光定量檢測試劑盒對cDNA中的miR-155及U6進行擴增。PCR反應體系如下:cDNA 2 μl,試劑盒內的Mixture 10 μl,上游引物0.6 μl,通用下游引物0.6 μl,去離子水補足至20.0 μl。PCR反應程序如下:95 ℃預變性3 min,95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s重復40個循環,根據循環曲線以U6為內參計算miR-155的表達量。

1.2.4 心肌p-p38MAPK表達檢測:取缺血再灌注部位的心肌組織適量,加入蛋白裂解液提取蛋白樣本,測定蛋白濃度后,將含有30 μg蛋白的樣本用于Western blot檢測,加入預先配制的聚丙烯酰胺凝膠后進行電泳、電轉PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,1∶1000稀釋的p-p38MAPK一抗或1∶4000稀釋的β-actin一抗4 ℃孵育過夜;次日,1∶2000稀釋的二抗室溫孵育2 h,最后在凝膠成像系統中顯影得到p-p38MAPK和β-actin,以β-actin蛋白條帶的灰度值作為內參計算p-p38MAPK表達水平。

1.2.5 心肌炎癥因子含量檢測:取缺血再灌注部位的適量心肌組織,采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平,按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差表示,多組間比較采用方差分析;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 過表達及敲低miR-155對MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的影響 見表1(圖1)。與陰性對照組比較,陰性對照+MIRI組大鼠心肌組織miR-155表達明顯降低,p-p38MAPK表達明顯增加(均P<0.05);與陰性對照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠心肌miR-155表達明顯降低,p-p38MAPK表達明顯增加(均P<0.05);與陰性對照+MIRI組比較,miR-155模擬物+MIRI組大鼠心肌miR-155表達明顯增加,p-p38MAPK表達明顯降低(均P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織p-p38MAPK表達電泳圖

表1 各組大鼠心肌組織miR-155、p-p38MAPK表達比較

2.2 過表達及敲低miR-155對MIRI大鼠血清心肌酶含量的影響 見表2。與陰性對照組比較,陰性對照+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05);與陰性對照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05),miR-155模擬物+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯降低(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清CK-MB、LDH含量比較(U/L)

2.3 過表達及敲低miR-155對MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎癥因子的影響 見表3。與陰性對照組比較,陰性對照+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05);與陰性對照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05),miR-155模擬物+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯降低(均P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比較(ng/mg prot)

2.4 溫陽振衰顆粒對MIRI大鼠血清心肌酶含量的影響 見表4。與對照組比較,MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05)。

表4 各組大鼠血清CK-MB、LDH含量比較(U/L)

2.5 溫陽振衰顆粒對MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK途徑的影響 見表5(圖2)。與對照組比較,MIRI組大鼠心肌miR-155表達明顯降低,p-p38MAPK表達明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠心肌miR-155的表達明顯增加,p-p38MAPK表達明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠心肌miR-155表達明顯降低,p-p38MAPK表達明顯增加(均P<0.05)。

圖2 各組大鼠心肌p-p38MAPK表達電泳圖

表5 各組大鼠心肌miR-155、p-p38MAPK表達比較

2.6 溫陽振衰顆粒對MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎癥因子的影響 見表6。與對照組比較,MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05)。

表6 各組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比較(ng/mg prot)

3 討 論

缺血再灌注損傷是冠狀動脈旁路移植手術、急性心肌梗死介入手術等過程中心肌必經的病理生理過程,受到炎癥反應、氧化應激、凋亡、自噬等因素的影響,可出現MIRI,并增加多種心血管危重并發癥的風險[8-11]。近年來,中醫藥在MIRI防治中的價值受到了越來越多關注。有研究報道,補陽還五湯、益氣降濁湯、雙參通脈顆粒等中藥均能在大鼠MIRI中起到保護作用[12-15]。

溫陽振衰顆粒是以附子、干姜、甘草、紅參為主要成分的中藥顆粒劑。相關研究發現,溫陽振衰顆粒在慢性心衰、阿霉素誘導損傷、膿毒癥誘導損傷的模型中具有心肌保護作用[2,16-17]。溫陽振衰顆粒含藥血清通過調控miR-155/p38MAPK途徑減輕阿霉素誘導的心肌細胞損傷[3]。miR-155對p38MAPK的靶向調控作用與其抑制MAP3K10、MKK3、MKK6等的激活有關,miR-155靶向抑制p38MAPK的激活能夠削弱p38MAPK介導的炎癥反應,減少TNF-α、IL-6生成[18-19]。本實驗分析MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的變化可知:MIRI組大鼠心肌miR-155表達降低,p-p38MAPK表達及其下游TNF-α、IL-6含量增加,表明miR-155/p38MAPK通路在MIRI過程中發生改變,下游炎癥反應明顯激活。在加用溫陽振衰顆粒灌胃干預后,中藥組大鼠心肌miR-155表達增加,大鼠心肌miR-155表達及其下游TNF-α、IL-6含量降低,表明溫陽振衰顆粒參與MIRI過程中miR-155/p38MAPK通路的調控,這可能是溫陽振衰顆粒減輕MIRI的分子機制。

中醫理論認為MIRI屬于胸痹范疇,病機在于陰乘陽位、胸陽痹阻所造成的血脈運行不暢[20-23]。溫陽振衰顆粒能夠針對MIRI病機發揮扶陽破陰、逐寒救逆的作用,在MIRI中起心肌保護作用[24-25]。本實驗采用溫陽振衰顆粒灌胃的方式進行干預,灌胃14 d后進行MIRI造模,MIRI組血清心肌酶含量較對照組增加,而中藥組血清心肌酶含量較MIRI組降低,表明溫陽振衰顆粒能夠在MIRI過程中起保護作用、減輕心肌損傷的程度,與該顆粒劑在其他模型中介導的心肌保護作用吻合[26-27]。為闡明溫陽振衰顆粒是否通過miR-155/p38MAPK通路減輕MIRI,本研究驗證了miR-155在MIRI中的作用。在MIRI造模前分別在心肌局部注射miR-155的抑制物和模擬物,造模后觀察心肌損傷程度,結果顯示抑制miR-155表達后,MIRI加重且p38MAPK進一步激活,下游TNF-α及IL-6生成進一步增多;而上調miR-155表達后,MIRI減輕且p38MAPK激活減弱,下游TNF-α及IL-6生成減少。以上結果表明miR-155在MIRI中起保護作用,并且能夠靶向抑制p38MAPK的激活及下游炎癥因子的釋放。最后,本研究還通過局部注射miR-155抑制物的方式驗證溫陽振衰顆粒減輕MIRI的機制,在溫陽振衰顆粒灌胃過程中給予miR-155抑制物心肌局部注射,而后進行MIRI造模,造模后觀察到抑制miR-155表達能夠削弱溫陽振衰顆粒減輕MIRI的作用,由此證實溫陽振衰顆粒減輕MIRI的作用與上調miR-155表達有關。

綜上所述,溫陽振衰顆粒通過調控miR-155/p38MAPK途徑減輕大鼠MIRI,并且miR-155能夠在心肌MIRI過程中靶向p38MAPK,抑制炎癥并減輕心肌損傷。