雷公藤乙素對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷自噬作用及免疫代謝的影響

張 磊,劉超楠,韓秀濤,趙靜宇,周曉霜

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030619;2.山西省人民醫(yī)院,山西 太原 030012;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京肝病研究所,北京 100069)

糖尿病腎病(Diabetic kidney disease,DKD)是臨床常見的糖尿病并發(fā)癥,在DKD發(fā)病早期常常會(huì)出現(xiàn)少量蛋白尿,在疾病發(fā)展的后期,DKD患者會(huì)出現(xiàn)尿毒癥和心血管的損傷,并且有較高的病死率[1-2]。DKD在中醫(yī)學(xué)可歸于消渴病范疇,其病機(jī)核心為虛、瘀、濁,而虛是消渴病發(fā)病的基本條件[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為DKD早期病機(jī)以氣陰兩虛為主,逐漸引起脾腎兩虛。虛實(shí)寒熱、陰陽病損的復(fù)雜病理機(jī)制會(huì)促進(jìn)DKD的發(fā)展進(jìn)程[4]。中醫(yī)的辨證分型與DKD的生存率有密切關(guān)聯(lián),DKD最常見的證型為氣虛血瘀證和氣陰兩虛證,而DKD生存率低的證型為陰陽俱虛證和血瘀痰凝證,預(yù)后不良[5]。《景岳全書》指出消渴病的下消又稱作腎消,病位在腎,腎消會(huì)使精津大量外泄,導(dǎo)致津液輸布障礙,出現(xiàn)尿濁、水腫等并發(fā)癥[6]。西醫(yī)認(rèn)為自噬在DKD中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,自噬又稱為巨自噬,會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)實(shí)體溶酶體降解[7]。DKD、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥和多囊腎病的發(fā)病機(jī)制均歸結(jié)于自噬的失調(diào)[8]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glucose transporter 1,GLUT-1)是腎小球系膜細(xì)胞上主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,和糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān),其可通過多種機(jī)制導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[9]。樹突狀細(xì)胞(DC)發(fā)揮提呈傳遞抗原的作用,是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的免疫細(xì)胞,能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生和維持機(jī)體免疫平衡[10]。DKD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,自身免疫功能異常影響DKD的發(fā)生和發(fā)展[11]。目前,臨床針對(duì)DKD主要有降糖、降壓、減少尿蛋白、生活干預(yù)等治療手段,但是療效欠佳。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)雷公藤能夠治療自身免疫性疾病,比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等,具有很好的臨床療效[12]。雷公藤主要通過影響免疫調(diào)節(jié)作用、激活MAPK通路、改變腎臟的蛋白表達(dá)等途徑來保護(hù)腎臟[13]。雷公藤甲素和雷公藤乙素都是雷公藤的有效成分。研究表明,雷公藤甲素能夠保護(hù)足細(xì)胞,能夠激活足細(xì)胞的活性,從而抑制炎癥反應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn),雷公藤乙素能夠降低轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá),改善腎功能[15]。目前,對(duì)于雷公藤乙素的研究還比較局限,因此,本文主要研究足細(xì)胞的自噬水平,探討雷公藤乙素促進(jìn)自噬減輕足細(xì)胞損傷機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究高糖條件下炎癥因子、免疫功能的變化和GLUT-1表達(dá),為雷公藤乙素治療DKD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系:小鼠腎足細(xì)胞系MPC5由山西省人民醫(yī)院腎病研究所贈(zèng)予。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);VIVO培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司);葡萄糖(美國Merck Millipore公司);LC3A/B Antibody抗體(美國Sigma公司);Anti-p62抗體(美國Cell signaling公司);重組Anti-mTOR抗體(美國Cell signaling公司);Percp mouse anti-human CD3、PE Mouse Anti-Human CD4、FITC Mouse Anti-Human CD8(美國BD公司);雷公藤乙素(上海繁泰生物科技有限公司);RNA提取試劑TRIzol Reagent(美國Merck Millipore公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Takara公司);人重組白介素-4(IL-4)、人重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白(美國Peprotech公司);人MHC-Ⅱ抗體(美國PTG公司);APC mouse anti-human CD54、FITC Mouse Anti-Human CD86、GLUT-1(美國BD公司);Maker(美國Sigma公司);2× Loading buffer(上海生物工程股份有限公司);β巰基乙醇(美國Merck Millipore公司);β-actin Rabbit mAb抗體(北京索萊寶科技有限公司);TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國Sigma公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:離心機(jī)(格羅貝爾機(jī)電有限公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);成像流式細(xì)胞儀(美國Merck Millipore公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng)及分組:復(fù)蘇足細(xì)胞系,用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)足細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代增殖,繼而接種至10 cm培養(yǎng)皿(5.0×106個(gè)/皿),隨后分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別為正常對(duì)照組、高糖組(葡萄糖30 mmol/L)、高糖+雷公藤乙素組。

1.2.2 Western blot檢測足細(xì)胞蛋白表達(dá):收集各組細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞2次,按100∶1比例加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑,刮下細(xì)胞,裂解30 min,然后4 ℃、12000 r/min離心10 min,棄去沉淀,加入2×Loading buffer,置于100 ℃水浴鍋中變性10 min。然后樣本置于4 ℃保存。配制6%～12%的SDS-PAGE凝膠,待各組上樣、凝膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,一抗、二抗分別孵育。兔抗鼠哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p62、LC3、腎小球足細(xì)胞裂隙膜蛋白(Podocin)、腎病蛋白(Nephrin)均按抗體說明書1∶1000稀釋。24 h室溫下復(fù)溫后1×TBST洗一抗3次,每次20 min,室溫孵育兔二抗1 h,1×TBST洗二抗3次,每次20 min,加發(fā)光液,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描,并計(jì)算LC3、p62、mTOR、Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)。

1.2.3 RT-PCR檢測足細(xì)胞各炎癥因子mRNA表達(dá):TRIzol試劑提取各組細(xì)胞 RNA,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄條件:30 ℃ 10 min,42 ℃ 30～60 min,95 ℃ 5 min。然后在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,44個(gè)循環(huán);計(jì)算炎癥因子白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6) mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 DC細(xì)胞培養(yǎng)與測定:取DKD患者和健康者外周靜脈血,PBS等量稀釋后,2000 r/min離心20 min,收集外周血單個(gè)核細(xì)胞,按2×106細(xì)胞/孔種植于12孔板中,加入RPMI 1640培養(yǎng)液,置于含5%CO2、37 ℃孵箱中,2 h后移除非貼壁細(xì)胞,將非貼壁細(xì)胞凍存,保留貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞加入內(nèi)含終濃度GM-CSF(800 U/ml)和IL-4(1000 U/ml),繼續(xù)培養(yǎng),隔日換液,觀察細(xì)胞的生長情況,在第5日,更換培養(yǎng)基(含細(xì)胞因子),第6日加入TNF-α(1000 U/ml),第7日收集細(xì)胞,離心后PBS重懸細(xì)胞并加入HLA-DR MHCⅡ、CD86、CD54抗體各2.5 μl于流式上機(jī)管中,混勻,室溫染色30 min,PBS洗滌細(xì)胞。離心后,PBS重懸細(xì)胞,4 ℃保存,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞HLA-DR MHCⅡ、CD54和CD86抗體熒光表達(dá)情況。或者將收集的細(xì)胞置于1.5 ml的EP管中,離心后用PBS重懸細(xì)胞加入HLA-DR MHCⅡ和GLUT-1抗體各2.5 μl,放在渦旋儀上混勻,室溫染色30 min,PBS洗滌。離心后,PBS重懸細(xì)胞,成像流式細(xì)胞儀測定用HLA-DR標(biāo)記的DC細(xì)胞GLUT-1的表達(dá)情況。

1.2.5 T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)與測定:第7日收集DC細(xì)胞,復(fù)蘇非貼壁細(xì)胞,即淋巴細(xì)胞,DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按1∶10的比例加入,三組DC細(xì)胞與對(duì)應(yīng)的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)于12孔板中,加IL-2 (50 U/L)培養(yǎng)4 d。然后將懸浮細(xì)胞加入流式上機(jī)管中,離心后PBS重懸細(xì)胞,加入CD3、CD4和CD8抗體各3 μl,室溫染色30 min,PBS洗滌細(xì)胞。離心后,PBS重懸細(xì)胞,4 ℃保存,流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組間比較采用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組足細(xì)胞LC3、p62、mTOR、Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)比較 見表1(圖1)。與正常對(duì)照組比較,高糖組LC3、mTOR、Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)量顯著降低,p62蛋白表達(dá)增強(qiáng)(均P<0.05);與高糖組比較,高糖+雷公藤乙素組Nephrin、mTOR蛋白表達(dá)升高,p62表達(dá)降低(均P<0.05),LC3、Podocin蛋白表達(dá)雖升高,相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1 各組足細(xì)胞LC3、p62、Podocin、Nephrin、mTOR蛋白表達(dá)電泳圖

表1 各組足細(xì)胞LC3、p62、Podocin、Nephrin、mTOR蛋白表達(dá)比較

2.2 各組足細(xì)胞IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)比較 見表2。與正常對(duì)照組比較,高糖組IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子mRNA表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05);與高糖組比較,高糖+雷公藤乙素組IL-1α、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯改善(均P<0.05),IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平雖有改善,但是相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組足細(xì)胞IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)比較

2.3 各組DC細(xì)胞表面分子HLA-DR MHCⅡ、CD86、CD54表達(dá)比較 見表3。與正常對(duì)照組比較,DKD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化,分化成的DC細(xì)胞表達(dá)HLA-DR MHCⅡ、CD86、CD54的平均熒光值明顯降低(均P<0.05);與DKD組比較,DKD+雷公藤乙素組DC細(xì)胞表達(dá)HLA-DR MHCⅡ、CD86、CD54平均熒光值較高(均P<0.05)。

表3 各組DC細(xì)胞表面分子HLA-DR MHCⅡ、CD86、CD54表達(dá)比較(%)

2.4 各組T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+表達(dá)比較 見表4。與正常對(duì)照組比較,DKD組T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+表達(dá)降低(均P<0.05);與DKD組比較,DKD+雷公藤乙素組T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+表達(dá)升高(均P<0.05)。

表4 各組T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+表達(dá)比較(%)

2.5 各組DC細(xì)胞GLUT-1表達(dá)比較 見表5。與正常對(duì)照組比較,DKD組用HLA-DR熒光標(biāo)記DC細(xì)胞GLUT-1表達(dá)量較低(P<0.05);與DKD組比較,DKD+雷公藤乙素組用HLA-DR熒光標(biāo)記DC細(xì)胞GLUT-1表達(dá)量升高(P<0.05)。

表5 各組DC細(xì)胞GLUT-1表達(dá)比較(%)

3 討 論

DKD是一種微小血管的持續(xù)性病變[16]。DKD發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,主要包括糖代謝紊亂、腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變、多種細(xì)胞因子等因素導(dǎo)致腎小球功能不可逆地下降,從而患者出現(xiàn)大量的蛋白尿[17-18]。研究表明,自噬在腎臟疾病中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,在機(jī)體高糖條件下,失調(diào)的自噬會(huì)加重腎臟腎小球和腎小管間質(zhì)的惡性病變[19]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)分解代謝,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)揮重要的作用,目前調(diào)控自噬的主要有mTOR、AMPK以及SIRT1三條通路,DKD足細(xì)胞損傷的相關(guān)信號(hào)通路包括mTOR/自噬、TGF-β1以及Notch等[20]。吳冰等[21]運(yùn)用枸杞多糖抑制Notch通路,改善DKD大鼠腎臟纖維化,減輕足細(xì)胞損傷和腎功能。另外,DKD的發(fā)生和發(fā)展與免疫系統(tǒng)的破壞密切相關(guān),DC細(xì)胞是一類獨(dú)特的免疫細(xì)胞,是先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁,主要發(fā)揮提呈傳遞抗原的作用[22-23]。DKD是由于機(jī)體內(nèi)葡萄糖水平急劇升高而造成的腎臟損害,葡萄糖不能自由出入細(xì)胞,需要借助膜蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),GLUT-1是位于腎小球系膜上的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的代謝以及葡萄糖的攝取[24-25]。因此,GLUT-1表達(dá)水平可用于評(píng)估DKD腎臟損傷程度。

在中醫(yī)學(xué)范疇,DKD又稱“消渴”“水腫”“虛勞”“關(guān)格”,中醫(yī)認(rèn)為腎虛是DKD的根本,血瘀是DKD的病機(jī),腎虛血瘀貫穿DKD發(fā)展的始終[26]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DKD屬于本虛標(biāo)實(shí),其病位主要在肝腎,中醫(yī)有肝腎同源之說,二者相互累及,但與其他臟腑也有密切的關(guān)系[27]。DKD疾病發(fā)展的各個(gè)階段其證候各異,中醫(yī)根據(jù)患者不同時(shí)期的癥狀表現(xiàn)進(jìn)行辨證論治取得顯著療效。劉晶等[28]采用益腎固攝活血通絡(luò)法治療DKD,可改善患者蛋白尿,降低血糖水平。魏華娟等[29]運(yùn)用通絡(luò)解毒湯灌服DKD大鼠,結(jié)果表明DKD大鼠血肌酐、尿素氮和空腹血糖水平均下降。劉芳等[30]研究結(jié)果表明,養(yǎng)生益腎湯治療DKD可顯著降低甘油三酯、低密度膽固醇以及血清細(xì)胞因子等指標(biāo)水平,改善腎功能。目前研究發(fā)現(xiàn),雷公藤制劑能夠治療多種腎臟疾病,雷公藤所含的化學(xué)物中五環(huán)三萜羧酸能夠治療自身免疫性疾病[31-32]。雷公藤可以抑制炎癥因子的分泌,避免氧化應(yīng)激,從而發(fā)揮對(duì)腎臟、足細(xì)胞的保護(hù)作用[33]。雷公藤的提取物主要為雷公藤多苷、雷公藤甲素和雷公藤乙素。雷公藤及其提取物影響T淋巴細(xì)胞子集的比率、巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)、單核細(xì)胞分化成DC的免疫反應(yīng)以及多種細(xì)胞因子的分泌[34]。艾麗曼等[35]研究結(jié)果表明,雷公藤多苷聯(lián)合小劑量激素治療特發(fā)性膜性腎病,能夠降低尿微量白蛋白、血清腎損傷分子水平,改善腎功能。任凌燕等[36]研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素能夠抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)因子的表達(dá),使DKD小鼠模型足細(xì)胞損傷減輕,改善蛋白尿,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。楊朔等[37]研究顯示,雷公藤乙素能夠改善DKD大鼠腎臟損傷,降低炎癥因子表達(dá),下調(diào)腎組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)。但是目前尚無雷公藤乙素通過減輕足細(xì)胞損傷來激活自噬活性以及改善免疫代謝功能的相關(guān)研究,故本研究對(duì)其進(jìn)行探討。本研究在高糖條件下培養(yǎng)足細(xì)胞,促使足細(xì)胞損傷,足細(xì)胞表面標(biāo)志Podocin、Nephrin蛋白表達(dá)下降,雷公藤乙素干預(yù)后,其蛋白表達(dá)增強(qiáng);高糖足細(xì)胞自噬指標(biāo)LC3、mTOR蛋白表達(dá)也下降,p62蛋白表達(dá)增強(qiáng),雷公藤乙素干預(yù)后,LC3、mTOR蛋白表達(dá)增強(qiáng),p62蛋白表達(dá)下降。高糖足細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生促炎癥因子,IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組升高,雷公藤乙素干預(yù)后,各炎癥因子mRNA表達(dá)下降,但是未接近正常水平。DKD組DC細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-DR MHCⅡCD86、CD54和T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+的表達(dá)較正常對(duì)照組降低,雷公藤乙素可上調(diào)其表達(dá)。DKD組GLUT-1表達(dá)較正常對(duì)照組下降,表明雷公藤乙素可促進(jìn)糖代謝,上調(diào)GLUT-1表達(dá)。

綜上所述,雷公藤乙素能夠減輕DKD足細(xì)胞損傷,激活自噬的活性,能夠使DC有效激活T淋巴細(xì)胞,改善免疫功能,并能夠調(diào)節(jié)糖代謝。