羧甲基化與接枝化改性對小米糠膳食纖維結構與理化性質的影響

曹家瑋，郭益孜，李艷，張穎，李俊茹，鄭亞軍

（山西師范大學食品科學學院，山西 太原 030092）

可溶性膳食纖維（soluble dietary fibre，SDF）是影響膳食纖維功能活性的主要因素，與不溶性膳食纖維（insoluble dietary fibre，IDF）相比，其具有更好的持水性、吸油性、膨脹力和金屬離子交換能力[1]。SDF 在增強飽腹感、加強胃腸道蠕動、預防和治療便秘、降血糖、維持人體腸道微生物平衡與滲透壓穩定、排毒等方面具有顯著作用[2-4]。聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）推薦的膳食纖維中，可溶性膳食纖維的含量應大于10%。然而，植物膳食纖維尤其是谷物纖維中SDF 的含量遠低于這一推薦值[5]。

小米糠是小米脫殼后的副產物，其纖維含量高達30%～41%，產量大、價格低廉，是良好的膳食纖維原料[6]。然而小米糠膳食纖維中大部分是不溶性膳食纖維，導致其持水力、膨脹性、降糖降脂能力以及金屬離子交換能力均較差[7]。因此，有效提高小米糠中可溶性膳食纖維的含量，改善其理化性質與功能活性是小米產業亟待解決的問題。研究表明，羧甲基化和接枝化可以分別將強極性的羧甲基和羧基引入纖維素結構中，有效提高纖維素的極性，從而提高其理化性質和功能活性[8-9]。目前羧甲基化纖維素和接枝化淀粉已經廣泛應用于食品工業，是安全、無毒、應用廣泛的纖維素改性產品[4，10]。近年來，有學者采用超微粉碎、螺桿擠壓、纖維素酶水解與微生物發酵等方法對小米糠纖維進行改性[6，11-14]。同時采用羧甲基化與接枝化對小米糠進行改性的研究鮮有報道。因此，本試驗同時采用接枝化和羧甲基化對小米糠膳食纖維進行改性，重點分析不同改性處理對小米糠膳食纖維的化學組成與理化性質的影響，為小米深加工產業提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米糠：市售，為當年新鮮小米脫粒副產物。

糖化酶（1.0×104U/g）、堿性蛋白酶（1.0×105U/g）、風味蛋白酶（1.0×104U/g）：上海玉博生物科技有限公司；冰乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、一氯乙酸、丙烯酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

JSM-7500F 型掃描電子顯微鏡：日本Tokyo 公司；Dor YJA 型電子天平：渡揚精密儀器（上海）有限公司；HHM4 型恒溫水浴鍋：常州金壇精達儀器制造有限公司；BGX 型恒溫干燥箱：上海儀電科技有限公司；TD-4M型離心機：江蘇華大離心機制造有限公司；BPH-7200型pH 計：天津市泰斯特儀器有限公司；FS-II 型實驗型旋風式粉碎磨：螞蟻源科學儀器（北京）有限公司；NH310 型色差儀：深圳市三恩馳科技有限公司；BT-2000 E 型激光粒度儀：上海鑫天精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米糠膳食纖維的制備

將小米糠粉碎并過60 目篩。稱取小米糠粉末30 g，加入pH7.4 磷酸緩沖溶液（600 mL、0.1 mol/L），搖勻，加入α-淀粉酶2 g，90 ℃恒溫水浴攪拌反應2 h，冷卻至50 ℃。用鹽酸（0.1 mol/L）調pH 值至8.0，接著加入堿性蛋白酶0.2 g、風味蛋白酶0.2 g，然后50 ℃恒溫水浴中攪拌反應3 h，用0.1 mol/L HCl 調節pH 值至2.0。再加入0.5 g 的糖化酶，搖勻后，在60 ℃恒溫水浴中攪拌2 h，然后在100 ℃下加熱15 min，取出冷卻至室溫。用濾紙進行過濾后收集濾渣，50 ℃干燥4 h，制得小米糠膳食纖維（millet bran dietary fibre，MBDF）[6]。

1.3.2 接枝化改性

精確稱取小米糠膳食纖維1 g，加入120 mL 蒸餾水（distilled water，dH2O），室溫連續攪拌10 min。取16 mL NaOH 溶液（1 mol/L）與10 mL 丙烯酸混勻，冷卻后加入到反應體系中，攪拌10 min 后，70 ℃恒溫反應3 h[8]。冷卻，用dH2O 洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌。收集沉淀物，45 ℃下干燥8 h，制得接枝化小米糠膳食纖維（grafted millet bran dietary fibre，MBDF-G）。接枝化程度采用Rani 等[15]的方法測定。

1.3.3 羧甲基化改性

精確稱取小米糠膳食纖維8 g 于錐形瓶中，加入80 mL、85%乙醇，然后緩慢加入50 mL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L），混勻后在35 ℃下反應1 h[9]。然后加入30 mL 一氯乙酸和50 mL、85%乙醇溶液，攪拌均勻后在53 ℃下恒溫反應3.5 h，冷卻至室溫。調節反應液pH 值至7.0，4 000×g 下離心15 min，收集沉淀，并用無水乙醇洗滌3～5 次，在45 ℃下干燥4 h，獲得羧甲基化小米糠膳食纖維（carboxymethylated millet bran dietary fibre，MBDF-C）。纖維的羧基化程度采用Wang 等[10]的方法進行測定。

1.3.4 小米糠膳食纖維的化學成分測定

水分含量采用恒重法測定，蛋白質含量采用凱氏定氮法測定，脂肪含量采用索氏抽提法測定，灰分采用馬弗爐法測定，可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維與總膳食纖維含量均采用酶-重量法進行測定[7]，纖維素、半纖維素和木質素的測定均按照Zhu 等[11]的方法進行。

1.3.5 粒徑與色澤測定

利用BT-2000 E 型激光粒度儀測定各小米糠纖維的粒徑與比表面積（m2/kg），粒徑以D3，2（μm）表示，具體步驟參照Zheng 等[7]的方法進行。同時，以未改性的小米糠膳食纖維為對照，用NH310 型色差儀對各改性小米糠膳食纖維的色差（ΔE）進行測定，計算公式見式（1）。

式中：ΔE 為改性小米糠膳食纖維的色差；L*、b*和a*分別為樣品的亮度、藍值和紅值；L0*、a0*、b0*分別為未改性小米糠膳食纖維的亮度、藍值和紅值。

1.3.6 傅里葉紅外光譜掃描

傅里葉紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR）掃描按照Zheng 等[7]的方法進行。掃描范圍為4 000～400 cm-1，狹縫4 cm-1。

1.3.7 表面微觀結構的觀察

將過100 目篩的小米糠、小米糠膳食纖維、接枝化小米糠膳食纖維和羧甲基化小米糠膳食纖維分別干燥直至恒重后，利用JSM-7500F 型掃描電子顯微鏡觀察表面微觀結構，參數設定為放大倍數×5 000、額定電壓10 kV、電鏡標尺1 μm[9]。

1.3.8 持水力的測定

稱量小米糠膳食纖維樣品0.500 g（X0）放置于15 mL 的離心管中，稱取纖維樣品與離心管的總質量（X1），緩慢加入10 mL dH2O，攪拌，在室溫下靜置12 h后離心（4 000×g，25 min），倒掉上清液，稱量帶有樣品的離心管總質量（X2）[6]。持水力按公式（2）計算。

式中：W 為持水力，g/g。

1.3.9 膨脹力的測定

將0.250 g 小米糠膳食纖維樣品（m）裝入10 mL量筒內，搖勻，讀出體積（Va）[8]。然后加入5 mL dH2O，攪拌、振蕩去除產生的氣泡后，在室溫下靜置18 h，讀出體積（Vb）。按公式（3）計算膨脹力。

式中：E 為膨脹力，mL/g。

1.3.10 持油力的測定

稱取1 g 小米糠膳食纖維（m）放置于干凈的離心管內，稱量樣品與離心管的總質量（X1）[11]。并加10 mL豆油，室溫下持續攪拌15 min 后，靜置1 h，1 500×g 離心10 min，小心地去除上層豆油，稱其質量（X2）。持油力按公式（4）計算。

式中：H 為持油力，g/g。

1.3.11 陽離子交換能力的測定

將小米糠膳食纖維0.500 g（m）置于玻璃三角瓶中，加入20 mL 鹽酸溶液（0.1 mol/L），密封、室溫下靜置12 h，過濾，用dH2O 反復沖洗濾渣，用AgNO3溶液檢測濾液，直到不含Cl-。然后在洗滌后的濾渣中加入100 mL NaCl（5%）,磁力攪拌30 min 后用0.1 mol/L NaOH 滴定，以0.5%酚酞-乙醇溶液為指示劑，直至溶液變色后3 min 內不退色[16]。陽離子交換能力按公式（5）計算。

式中：C 為陽離子交換能力，mmoL/g；Va為滴定樣品所消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；Vb為滴定空白樣品所消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；m 為樣品干質量，0.500 g；0.1 為滴定所用氫氧化鈉溶液濃度，mol/L。

1.4 數據處理與分析

上述試驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS Version 16.0 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同改性方法對小米糠膳食纖維化學組成的影響

不同改性方法對小米糠膳食纖維化學組成的影響結果見表1。

表1 不同小米糠膳食纖維的化學組成Table 1 Chemical composition of different millet bran dietary fibres g/100 g

從表1 可以看出，小米糠和未改性小米糠膳食纖維中可溶性膳食纖維含量均較低（1 g/100 g 左右），不溶性膳食纖維是主要成分，且主要是半纖維素，這與已有的研究結果相一致[6，11]。羧甲基化小米糠膳食纖維和接枝化小米糠膳食纖維的可溶性纖維含量約為未改性小米糠纖維的7 倍和11 倍，結果表明，羧甲基化和接枝化對提高小米糠中可溶性膳食纖維含量的效果非常顯著。本試驗中，采用2 種方法改性后，小米糠膳食纖維的羧甲基化程度與接枝化程度分別為4.12%與1.93%。在改性過程中，小米糠纖維素的晶體結構被破壞，部分羥基暴露出來，在引發劑的幫助下，羧甲基和羧基取代了這些暴露出來的羥基。羧甲基和羧基的極性更強，因此顯著提高了小米糠纖維的極性，使其可溶性膳食纖維含量提高[9-10]。同時，羧甲基化和接枝化改性后，小米糠纖維中的脂肪含量、蛋白質含量和灰分含量均明顯降低，而總膳食纖維含量升高，這表明改性后的小米糠膳食纖維純度更高。

王娟等[17]、付曉康等[18]利用高溫高壓、蒸汽爆破-超微粉碎、超聲波等物理改性方法，可以把小米糠可溶性膳食纖維的含量提升至2.37～4.12 g/100 g。姜龍波等[6]利用纖維素酶對小米糠膳食纖維進行改性，結果表明纖維素酶可以將小米糠中可溶性膳食纖維含量提升至3.29 g/100 g。Zhu 等[11]的研究結果表明，利用半纖維素酶水解，可以將小米糠可溶性膳食纖維的含量提升至4.74 g/100 g。然而，這些改性方法的作用效果均不如羧甲基化與接枝化，其原因可能是羧甲基化與接枝化可以直接將極性更強的羧甲基與羧基引入到小米糠多糖鏈上，從根本上改善了水合性質[9]。

2.2 不同改性方法對小米糠膳食纖維粒徑與色澤的影響

不同改性方法對小米糠膳食纖維粒徑與色澤的影響結果見表2。

表2 不同改性方法對小米糠膳食纖維粒徑與色澤的影響Table 2 Effects of different modifications on particle size and color of millet bran dietary fibres

從表2 可以看出，經羧甲基化和接枝化后，小米糠膳食纖維的粒徑顯著變小，D3，2由107.24 μm 分別減小至85.34、82.65 μm，其比表面積則顯著變大（p＜0.05）。這是因為，在羧甲基化和接枝化中，強堿、加熱等處理會使小米糠膳食纖維的晶體結構被破壞、化學鍵斷裂、纖維鏈變短、纖維結構坍陷，最終使小米糠纖維的粒徑變小，比表面積增大[8，14]。粒徑與比表面積是膳食纖維理化性質與功能活性的重要影響因素。具有較大比表面積的纖維素在食品體系與人體胃腸道中，與油、水分子等的結合能力更強，表現出更高的功能活性[19]。與未改性的小米糠膳食纖維相比，羧甲基化小米糠膳食纖維和接枝化小米糠膳食纖維均有較大的色差。改性后，小米糠膳食纖維的a*與b*均增大，亮度（L*）顯著減小，色澤變深。主要原因是在高溫與強堿處理的作用下，纖維發生褐變反應，進而影響小米糠膳食纖維在食品中的應用[17]。

2.3 改性小米糠膳食纖維的傅里葉紅外光譜分析

為深入了解羧甲基化與接枝化對小米糠膳食纖維結構的影響，采用傅里葉紅外光譜進行分析，結果如圖1 所示。

圖1 不同小米糠膳食纖維的傅里葉紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of different millet bran dietary fibres

由圖1 可知，小米糠膳食纖維與2 種改性小米糠膳食纖維均為典型多糖的傅里葉光譜圖，在3 400、1 050、1 650 cm-1處均有特征吸收峰。其中，3 400 cm-1處的吸收峰是由多糖鏈中羥基（-OH）的振動引起[12]；1 050、1 650 cm-1處的吸收峰則分別對應多糖鏈中的碳氧鍵（C-O-H）與羧基（-COOH）的不規則振動[5，9]。與小米糠膳食纖維的FT-IR 圖譜相比，接枝化和羧甲基化后，吸收峰均發生了明顯的紅移或藍移。這表明改性過程中，小米糠膳食纖維多糖鏈之間的部分氫鍵被打斷，含羧基或羰基的化學基團被接入分子中。對于羧甲基化改性來說（MBDF-C），在2 923.5 cm-1附近的吸收峰藍移到了2 916.5 cm-1，而該吸收峰代表甲基（-CH3）上碳氫鍵（C-H）的拉伸振動[18]，這表明甲基被引入纖維分子中。此外，接枝化后，在1 275、1 513.8 cm-1處出現新的吸收峰[13]，也代表羧基的振動。上述結果均可以證明，改性后的小米糠膳食纖維的部分氫鍵被破壞，羧甲基與羧基被成功引入。化學鍵與化學基團的改變，必然導致纖維結構的改變，從而引起理化性質與功能活性發生變化[5]。

2.4 不同改性方法對小米糠膳食纖維表面微觀結構的影響

圖2 為各小米糠膳食纖維的表面微觀結構。

圖2 不同小米糠膳食纖維的表面微觀結構Fig.2 Surface microstructure of different millet bran dietary fibres

由圖2（a）可知，未改性小米糠膳食纖維的表面相對粗糙，有碎片聚攏。圖2（b）和圖2（c）表明，經羧甲基化和接枝化后，小米糠膳食纖維呈現蜂窩狀、多孔的結構。在羧甲基化與接枝化中，強堿、加熱等處理會使小米糠膳食纖維的晶體結構被破壞，化學鍵斷裂，導致纖維結構坍陷，表現出多孔狀的結構[10]。同時，原料殘留的一部分淀粉與蛋白質分子，在羧甲基化與接枝化中被進一步去除，留下空隙，使纖維的表面變得粗糙多孔[8]。多孔的表面結構利于膳食纖維對水分子、油分子及亞硝酸根離子等的吸附，使其具有較好的持水性、持油性與有害離子吸附能力，進而表現出較高的降血糖、降血脂與排毒能力[17]。同時，多孔粗糙的表面結構也是羧甲基化小米糠膳食纖維與接枝化小米糠膳食纖維具有較小粒徑與較大比表面積的直觀證明。

2.5 不同改性方法對小米糠膳食纖維持水力的影響

持水力是評價膳食纖維與水相互作用力以及纖維在水相食品體系中應用前景的重要評價指標之一[19]。不同改性小米糠膳食纖維的持水力見表3。

表3 不同改性方法對小米糠膳食纖維持水力的影響Table 3 Effects of different modifications on water-holdingcapacity of millet bran dietary fibre g/g

由表3 可知，羧甲基化和接枝化改性后，小米糠膳食纖維的持水力從1.12 g/g 分別增加至2.69、2.29 g/g。主要原因是羧甲基化和接枝化后，大量極性較強的羧甲基和羧基被引入小米糠膳食纖維鏈中，可溶性纖維含量提高，從而使其持水力提升。其次，未改性小米糠膳食纖維的空間構造比較緊密，水分子無法充分與膳食纖維中的親水基團結合，所以持水力相對較低；而經改性后的小米糠膳食纖維，膳食纖維分子間的某些氫鍵被打開，使親水基團暴露出來，親水基團與水分子更加充分地接觸，增加了與水分子結合的作用面積，從而提高了持水力[9]。此外，接枝化小米糠膳食纖維的持水力與羧甲基化的接近，均顯著高于未改性小米糠膳食纖維的持水力，表明這2 種改性方法均可以使小米糠膳食纖維的持水力提高。

2.6 不同改性方法對小米糠膳食纖維膨脹力的影響

不同改性小米糠膳食纖維的膨脹力見表4。

表4 不同改性方法對小米糠膳食纖維膨脹力的影響Table 4 Effects of different modifications on water-swelling capacity of millet bran dietary fibre mL/g

從表4 可以看出，改性后的小米糠膳食纖維膨脹力得到顯著提高（p＜0.05）。這是因為改性提高了小米糠膳食纖維的可溶性膳食纖維含量，同時改變了小米糠膳食纖維的表面微觀結構。由于持水力增大，膳食纖維中充分吸水，使得小米糠膳食纖維的空間結構更加蓬松，體積增大，從而使膨脹力增加[20]。總體來說，羧甲基化改性對小米糠膳食纖維的膨脹力的改善效果最好，這與其蜂巢狀的多孔結構有關。因為多孔結構的比表面積更大，更容易與水分子結合，從而表現出更高的持水力和膨脹力[16]。

2.7 不同改性方法對小米糠膳食纖維持油力的影響

持油力是評價膳食纖維體內降血脂功能的重要指標之一[2]。不同改性小米糠膳食纖維的持油力見表5。

表5 不同改性方法對小米糠膳食纖維持油力的影響Table 5 Effects of different modifications on oil holding power of millet bran dietary fibre g/g

由表5 可知，經羧甲基化和接枝化后小米糠膳食纖維的持油力顯著提高（p＜0.05）。這是因為改性后小米糠膳食纖維的空間結構被改變，呈現更加多孔狀，比表面積增大，對油脂分子的吸附能力增大，從而使持油力增加[13]。綜合表3、表5 的結果可以看出，羧甲基化和接枝化既提高了小米糠膳食纖維的持水力，也提高了其持油力。有研究表明，持水力與持油力是對立的。膳食纖維的持水力和持油力的影響因素不同。決定膳食纖維持水力的主要是化學組成、特征基團的極性等，而纖維素的持油力則與其化學組成、疏水性、粒度、表面微觀結構密切相關[17，21]。持油力較高意味著小米糠膳食纖維進入人體的胃、腸道后，通過吸收食物中的油脂，體積膨脹，從而引起人的飽腹感，不僅能有效減少進食量以及對脂肪的攝入，起到減肥的效果，還能促進消化道的運動，加快體內代謝物的排出及減輕有害物質對人體的危害[3]。

2.8 不同改性方法對小米糠膳食纖維陽離子交換能力的影響

不同改性小米糠膳食纖維的陽離子交換能力見表6。

表6 不同改性方法對小米糠膳食纖維陽離子交換能力的影響Table 6 Effects of different modifications on cation-exchanging capacity of millet bran dietary fibre mmol/g

從表6 可以看出，接枝化和羧甲基化后，小米糠膳食纖維的陽離子交換能力分別提高了5.34 倍和0.75倍。主要原因是改性后，小米糠膳食纖維的多糖鏈中引入了大量的羧甲基與羧基。這2 種基團的極性與負電性均較強，可以極大提升膳食纖維與陽離子的結合能力或靜電吸引能力，因此表現出較高的陽離子交換能力[9]。同時，改性使小米糠膳食纖維原有結構的氫鍵被破壞，使得小米糠膳食纖維中原有的一些側鏈基團被暴露出來，例如氨基、羥基等，這些側鏈基團可以與陽離子絡合，改性后側鏈基團增多，進而增大與陽離子的接觸面積和接觸幾率，使改性后的小米糠膳食纖維陽離子交換能力提高[8，22]。

3 結論與展望

本試驗結果表明，與未改性小米糠膳食纖維相比，羧甲基化小米糠膳食纖維與接枝化小米糠膳食纖維的總膳食纖維與可溶性膳食纖維的含量提高。改性后小米糠膳食纖維表面呈蜂窩狀、多孔狀結構，粒徑更小，比表面積增大。羧甲基化和接枝化改性后，小米糠膳食纖維的持水力從1.12 g/g 分別增加至2.69、2.29 g/g；而持油力則從2.19 g/g 分別提升至4.59、4.27 g/g。同時，接枝化和羧甲基化后，小米糠膳食纖維的陽離子交換能力分別是未改性小米糠膳食纖維的6.34 倍和1.75 倍。但這2 種改性方法均降低了小米糠膳食纖維的亮度。因此，羧甲基化和接枝化改性都是有效改善小米糠膳食纖維可溶性膳食纖維含量與部分理化性質的有效方法。

與超微粉碎、復合酶解等物理與化學型的改性方法相比，羧甲基化與接枝化能夠更好地提高小米糠中可溶性膳食纖維含量，進而改善其持水力、陽離子交換能力等性質。雖然生物酶法的作用條件相對溫和，產品似乎也更安全，但其作用機理相對復雜，改性過程也不容易掌握；而化學法的機理相對明確，靶點比較集中，直接從結構上進行改性，因而效果一般較好。然而，利用化學法對小米糠膳食纖維進行改性，其產品的安全性需要重點考慮。此外，將物理法、化學法與生物法相結合對小米糠膳食纖維進行改性，有待進一步研究。