超聲輔助提取日本莢蒾果實總三萜工藝優化及其抗氧化活性

常超，蔡海鶯，，陳瑞達，劉暢，趙敏潔，孫蓉，陳獻志

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；3.臨海市林業技術推廣和場圃旅游服務總站，浙江 臺州 317000）

日本莢蒾（Viburnum japonicum）是一種忍冬科、莢蒾屬植物，大多是落葉灌木或小喬木，白色花，紅色果實，果實形狀多為橢圓形或近圓形[1]。國內零星分布在浙江臺州、舟山等地，屬于瀕危植物屬[2]。日本莢蒾較耐寒，偏好有機質豐富的土壤，適合生長在陽光充足、低海拔的地區[1]。莢蒾屬植物含二萜、三萜、黃酮、環烯醚萜等多種化學成分，不同化學成分的功能特性不同，已有較多研究表明莢蒾屬植物具有多種藥理作用，如抗腫瘤作用[3-4]、抗氧化作用[5]、降血糖[6]、殺蟲和抗菌作用等[7]，具有較高的藥用價值[8]。此外，莢蒾果實鮮紅光亮，具有觀賞價值，還可用于泡酒[9]。

莢蒾屬植物中存在大量的抗腫瘤活性成分三萜類化合物[10]，主要為五環三萜[11]。從日本莢蒾中提取三萜類化合物的研究相對較少，胡疆等[9]從日本莢蒾中分離出5 種新的三萜類物質。從植物中提取非揮發性化合物的傳統方法有微波法輔助提取、回流法提取[7]、超聲法輔助提取、沉淀吸附法、有機溶劑萃取法、索氏提取法等[11-13]。但相關研究表明，浸提法、索氏提取法與其他方法相比較所需時間更長，提取效率更低[14-15]，超高頻電磁波提取法溫度改變較明顯，對提取物的生物活性有一定影響[16]，其他方法如萃取法和超高壓提取法等不僅對儀器設備具有較高要求，而且消耗的成本也相對更高[17]，相比較之下超聲波輔助法提取三萜類物質，所需儀器設備簡單易得、儀器和試驗過程簡單易操作且用時較短，提取效率較高[18]。因此，本研究選用超聲波輔助法提取日本莢蒾果實中三萜化合物，采用單因素試驗和響應面法確定最佳參數，以優化日本莢蒾果實中總三萜的提取工藝，并以提取物研究其抗氧化活性[19-20]，為日本莢蒾原料的合理開發提供更多的研究方向，更大程度發揮日本莢蒾的價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

日本莢蒾果：臨海市林業技術推廣和場圃旅游服務總站。

熊果酸標準品、香草醛、高氯酸、抗壞血酸（VC）、2，2-聯苯基-1-苦基肼基（2，2-biphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-l 聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-diazobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸：上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

試驗所用儀器設備見表1。

表1 儀器與設備Table 1 Instrumentation and equipments

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

樣品剔除次果和壞果后，在50 ℃恒溫干燥箱中干燥至質量不變，粉碎過40 目篩，收集粉末置于4 ℃冰箱中低溫保存備用。

1.3.2 熊果酸三萜標準曲線的制定

標曲的制定參照景炳年等[21]的方法并稍加改動。首先，準確稱取4.0 mg 干燥恒重的熊果酸標準品，放入10 mL 棕色容量瓶中，采用甲醇定容并搖勻，得到0.4 mg/mL 標準品溶液。向6 個10 mL 容量瓶中分別精確吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 標準對照品溶液，并將容量瓶置于60 ℃水浴鍋中，揮干甲醇溶劑，加入1 mL 高氯酸和0.4 mL 質量濃度為5 g/100 mL 的香草醛－冰醋酸溶液[22]。將混勻后的標準品溶液于60 ℃水浴鍋中水浴30 min 后，冷卻至室溫，用冰醋酸定容到10 mL。向96 孔微孔板中吸取各容量瓶中配制好的溶液100 μL，使用酶標儀測定標品溶液在550 nm 處的吸光度。每個樣品濃度做3 組平行。橫坐標x 為熊果酸質量，縱坐標y 為OD 值，標準曲線方程為y=1.396 3x+0.081 2，R2=0.999。

1.3.3 莢蒾總三萜的提取

精確稱取干燥至恒重的莢蒾粉末0.1 g 于離心管中，根據樣品和溶劑的比例加入不同體積分數的乙醇溶液，置于離心管中，按照不同的超聲溫度和超聲時間進行總三萜的提取[23]，超聲完成后2 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。

1.3.4 莢蒾總三萜含量及得率的測定

將不同條件下提取的莢蒾樣品溶液2 000 r/min離心5 min，精確吸取上清液0.2 mL，將其放入10 mL容量瓶中，60 ℃水浴揮干溶劑，后續操作步驟按照1.3.2進行。根據標準曲線方程，計算提取物中的總三萜質量濃度，并計算出不同條件下總三萜的提取率，計算公式如下[21]。

式中：X 為總三萜質量濃度，mg/mL；A 為吸光度；Y 為總三萜得率，%；m 為粉末質量，g；n 為稀釋倍數。

1.3.5 單因素試驗

考察乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）、料液比[1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0、1∶20.0（g/mL）]、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（20、40、60、80、100 min）對總三萜得率的影響。

1.3.6 響應面優化試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，遵循響應面Box-Behnken 試驗的設計要求[24]，以乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間為影響因素，以日本莢蒾中總三萜得率作為響應值設計試驗方案，因素水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素水平Table 2 Factors and levels of the response surface design

1.3.7 日本莢蒾中總三萜提取物抗氧化能力測定

1.3.7.1 日本莢蒾中總三萜對DPPH 自由基清除能力測定

精密稱取不同質量抗壞血酸（VC）標準品，溶于95%乙醇溶液中并定容，配制不同濃度梯度作為陽性對照組[25]，95%乙醇溶液加0.2 mg/mL DPPH 作為空白組。將提取并離心后的樣品溶液旋蒸濃縮，測濃縮液中總三萜含量，并按照不同濃度梯度進行稀釋，最終樣品濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，向96孔微孔板中吸取不同濃度梯度的樣品溶液100 μL，再吸取100 μL 0.2 mg/mL DPPH 乙醇溶液，充分混合，在避光環境中靜置30 min，待反應充分。同時，將100 μL 95%乙醇溶液加入不同濃度梯度的樣品溶液中作為對照組。測定517 nm 波長處的吸光度[26]。每個試驗做3組平行，最終取3 組平行試驗的平均值。按以下公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：X 為DPPH 自由基清除率，%；A1為不同濃度莢蒾樣品溶液與DPPH 混合后在517 nm 處測定得到的吸光度；A2為不同濃度莢蒾樣品溶液與乙醇溶液混合后在517 nm 處測得的吸光度；A0為與DPPH 混合的乙醇溶液在517 nm 處測得的吸光度。

1.3.7.2 日本莢蒾中總三萜對ABTS+自由基清除能力測定

精密稱取不同質量抗壞血酸（VC）標準品溶于95%乙醇溶液中并定容，配制為不同濃度梯度，作為陽性對照組[25]，95%乙醇溶液加0.2 mg/mL ABTS 為空白組。將提取并離心后的樣品溶液旋蒸濃縮，測定濃縮液中總三萜含量，并按照不同濃度梯度進行稀釋，最終樣品濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，向96孔微孔板中吸取不同濃度梯度下的樣品溶液100 μL，再吸取100 μL 0.2 mg/mL ABTS 乙醇溶液，充分混合，在避光環境中靜置30 min，待反應充分。同時，將100 μL 95%乙醇溶液加入不同濃度梯度的樣品溶液中作為對照組。測定517 nm 波長處的吸光度[26-27]。每個試驗做3 組平行，最終取3 組平行試驗的平均值。按以下公式計算ABTS+自由基清除率。

式中：X 為ABTS+自由基清除率，%；A1為不同濃度莢蒾樣品溶液與ABTS 混合后在517 nm 處測定得到的吸光度；A2為不同濃度莢蒾樣品溶液與乙醇溶液混合后在517 nm 處測得的吸光度；A0為與ABTS 混合的乙醇溶液在517 nm 處測得的吸光度。

1.4 數據處理

單因素過程所得到的數據利用Origin2021 進行分析，Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對總三萜得率的影響

乙醇濃度對總三萜得率的影響見圖1。

圖1 不同乙醇濃度對日本莢蒾總三萜得率的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentrations on the yield of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖1 可看出，乙醇濃度對日本莢蒾中總三萜得率有影響，總三萜得率在4.75%～6.75%，乙醇濃度僅在極低或極高時對總三萜得率影響較大，說明乙醇濃度高于某一范圍或者低于某個閾值均會降低某些三萜類化合物的溶解度，或增加莢蒾中一些醇溶性、脂溶性、色素等物質溶出量，達到影響總三萜化合物得率的效果，乙醇濃度處于40%～80%影響較平穩，當處于40%時獲得率呈最高水平，之后呈下降趨勢，所以將40%乙醇濃度選作較佳提取條件。

2.1.2 料液比對總三萜得率的影響

料液比對總三萜得率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對日本莢蒾總三萜得率的影響Fig.2 Effect of different ratio of material to liquid on the yield of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖2 可知，不同料液比對日本莢蒾中總三萜得率有著較為明顯的影響，總三萜得率在5.10%～8.78%，料液比為1∶7.5～1∶15.0（g/mL）時總三萜得率呈上升狀態，之后總三萜得率快速降低，可能是隨著乙醇用量的增加，溶液稀釋，濃度降低，超聲波對莢蒾粉末的作用減弱，乙醇提取的作用也相對減弱，最終導致總三萜得率降低。因此選擇1∶15.0（g/mL）作為提取日本莢蒾的較佳料液比。

2.1.3 超聲溫度對總三萜得率的影響

超聲溫度對總三萜得率的影響見圖3。

圖3 不同超聲溫度對總三萜得率的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic temperatures on the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

由圖3 可知，不同超聲溫度對日本莢蒾總三萜得率有明顯影響，總三萜得率在6.48%～8.91%，在50 ℃之前隨著溫度的上升總三萜類化合物的得率也隨之增加，這可能是由于分子間運動速度隨溫度升高而加快，分子間滲透和擴散能力增強，從而加大了三萜物質的溶出，但溫度繼續上升三萜物質得率降低，可能是溫度升高會導致三萜物質發生分解，或有其他物質溶出影響總三萜的含量，因此，最終選擇超聲溫度50 ℃作為較佳提取溫度。

2.1.4 超聲時間對總三萜得率的影響

超聲時間對總三萜得率的影響見圖4。

圖4 不同超聲時間對日本莢蒾總三萜得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

從圖4 可以看出，超聲時間對總三萜的得率影響不大，總三萜得率在5.30%～6.15%，在60 min 之前隨著超聲時間的延長，總三萜的得率也在逐漸增加，超聲時間過長反而導致總三萜得率降低，應該是在前期隨著超聲時間的延長組織破碎增加，導致內容物溶出增多，總三萜含量增加，繼續超聲會導致雜質增加，且會影響總三萜的穩定性，進而導致總三萜含量降低，因此，最終選擇60 min 為較佳超聲時間。

2.2 響應面法優化莢蒾總三萜的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果

試驗設計及結果如表3 所示。

表3 莢蒾中總三萜提取響應面試驗設計及結果Table 3 Orthogonal experimental design and results of total triterpenoids extraction from Viburnum japonicum

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗

由響應面試驗結果，利用Design-Expert 8.0.6 分析表3 數據，得出以日本莢蒾中總三萜得率（Y）為響應值的二次多項回歸模型為Y=8.78+0.34A+0.31B-0.014C+0.8D+1.39AB-0.18AC+0.31AD+0.22BC+0.29BD-0.26CD-1.7A2-1.46B2-0.36C2-0.58D2。

方差分析結果如表4 所示。

表4 二次回歸模型的方差分析結果Table 4 Variance analysis results of quadratic regression model

由表4 可知，該模型相關系數R2=0.979 2，決定系數說明總三萜得率的變化97.92%來自試驗設計中的4 種不同因素，表明該模型有效，模型擬合顯著，校正決定系數R2Adj=0.935 4 表明試驗數據93.54%的變化均可用該試驗模型解釋。一次項D、交叉項AB、二次項A2、B2、D2對日本莢蒾總三萜得率的影響表現為極顯著（P＜0.01），二次項D2對日本莢蒾總三萜得率的影響表現為顯著（P＜0.05）。其他相關因素的影響不顯著。試驗因素的F 值反映不同組合對響應值的影響程度，F 檢驗表明各因素對總三萜得率影響大小為超聲時間（D）＞料液比（B）＞乙醇濃度（A）＞超聲溫度（C）。

2.2.3 響應面交互作用分析

響應曲面圖可以用來評價任意兩因素間交互作用對日本莢蒾中總三萜提取的影響，并能確定出不同因素的最佳水平范圍。由試驗所得到的回歸模型得到響應曲面圖如圖5 所示。

圖5 任意兩因素的交互作用與日本莢蒾總三萜得率關系的響應面圖Fig.5 Response surface map of the relationship between the interaction of two factors and the extraction rate of total triterpenes from Viburnum japonicum

響應曲面坡度表明響應值對于操作條件改變的敏感程度，曲面越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變越敏感[28]；反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應值的影響也就越小[29]。從圖5 可以看出，乙醇濃度與料液比的交互作用顯著，即這2 個因素的交互作用對總三萜得率的影響顯著；此外，乙醇濃度與超聲溫度，乙醇濃度與超聲時間，料液比與超聲溫度，料液比與超聲時間，超聲溫度與超聲時間的交互作用不顯著。

2.2.4 最佳試驗條件及驗證試驗

通過響應面分析得到最優工藝條件為乙醇濃度40.77%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50.02 ℃、超聲時間73.64 min，在該理論條件下，日本莢蒾總三萜的得率為9.16%。為更加方便實現操作過程，改進了理論條件下的最優提取工藝，并確定最終提取工藝為乙醇濃度40%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間74 min，在改進后的最優工藝條件下總三萜實際得率為9.07%。該值接近理論條件下總三萜得率，說明該改進后的工藝參數可靠。

2.3 總三萜抗氧化活性的試驗結果

DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率測定結果如圖6 和圖7 所示。

圖6 莢蒾總三萜DPPH 自由基清除率影響Fig.6 Scavenging rate of total triterpene from Viburnum japonicumto DPPH free radical

圖7 莢蒾總三萜對ABTS+自由基清除率影響Fig.7 Scavenging rate of total triterpenoids from Viburnum japonicum to ABTS+free radicals

由圖6 可以看出，VC清除DPPH 自由基效果較好，且質量濃度的變化對其影響較小。從日本莢蒾提取的總三萜類化合物清除DPPH 自由基的效果低于VC。總三萜的質量濃度在0.5～2.0 mg/mL，日本莢蒾總三萜提取物對DPPH 自由基清除率隨著總三萜質量濃度的增加而增加，但是在質量濃度高于2.5 mg/mL 后日本莢蒾中總三萜對DPPH 自由基清除率趨于穩定。穩定后的日本莢蒾中總三萜提取物對DPPH 自由基的清除率為89%，具有相對較好的抗氧化性能。

從圖7 可以看出，VC對ABTS+自由基的清除效果較好且相對穩定，不隨質量濃度的改變而發生較大改變?？側瀑|量濃度在0.5～2.0 mg/mL 時，隨著總三萜質量濃度的增加，日本莢蒾總三萜提取物對ABTS+自由基的清除效果逐漸增強，質量濃度如果持續增加，對ABTS+自由基清除效果趨于穩定，在總三萜質量濃度高于2.5 mg/mL 后日本莢蒾中總三萜提取物對ABTS+自由基的清除率穩定在78%，日本莢蒾提取物中總三萜對ABTS+自由基有較好的清除效果。

3 結論

通過單因素與響應面試驗，應用響應面對數據處理及優化，建立提取過程的二次項多項式理論模型，結合實際操作情況確定最優提取條件為乙醇濃度40%、料液比1∶12.5（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲時間74 min，在改進后的工藝條件下總三萜得率為9.07%。進一步對莢蒾中總三萜提取物的抗氧化活性進行檢測，結果表示，日本莢蒾總三萜提取物對DPPH 自由基及ABTS+自由基的清除作用雖略低于VC，但也表現出相對較強的抗氧化活性。本文為進一步開發利用日本莢蒾中總三萜化合物等功能活性成分提供參考。