微生物降解制備水溶性茯苓多糖及其抗氧化活性

張熠璇，雷敏，黃家浩，蔡俊

（湖北工業(yè)大學，湖北 武漢 430068）

茯苓（Poria cocos）隸屬于真菌門（Eumycophyta）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、茯苓屬（Wolfiporia），又名茯靈、茯菟、松柏芋等[1]。茯苓具有鎮(zhèn)定安神[2]、健脾利尿的功效[3]，具有一定的食養(yǎng)特性。多糖是茯苓中的主要成分，其中約80%以上為水不溶性多糖，這種水不溶性多糖已被證實是一種含有少量β-（1，6）支鏈的β-（1，3）-葡聚糖[4]，由于該多糖不溶于水，幾乎沒有生物活性，需要對其進行結構修飾以達到提高溶解度和生物活性的目的。

近年來，對茯苓多糖（Poria cocos polysaccharides,PCP）的增溶改性主要通過化學法引入官能團對其進行結構修飾，如羧甲基化[5]、硫酸酯化[6]、磷酸化[7]等。但化學法存在高耗能和溶劑殘留的缺點，探索生物過程作為修飾多糖結構的替代方法是十分必要的。生物修飾大多通過酶降解多糖制備低聚糖[8-9]，Bian 等[10]利用水解酶定向切除糖苷鍵，使分子量降低，得到水溶性茯苓多糖。目前大多是利用微生物發(fā)酵作為提高多糖提取率的一種前處理方法，利用微生物發(fā)酵法直接降解多糖的研究鮮有報道[11-13]。微生物發(fā)酵利用完整的微生物細胞作為生物催化劑對外源化合物進行催化轉化，使發(fā)酵產酶的過程與酶作用過程合二為一，能夠縮短生產周期，降低生產成本[14]。

本文利用先前篩選出的一株能夠高效降解不溶性茯苓多糖的琉球曲霉，對其降解多糖的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，對降解后得到的水溶性茯苓多糖進行分離純化，得到單一組分的水溶性茯苓多糖，并進行紅外光譜分析、分子量的測定和抗氧化活性的評價。利用微生物發(fā)酵法，以綠色環(huán)保的方式對不溶性茯苓多糖進行降解，提高生物活性，對于拓展其在食品、醫(yī)藥領域的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：產自湖北英山；琉球曲霉：湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏菌株；葡萄糖、硫酸銨、氯化鈉、苯酚、硫酸、硝酸鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨（生物試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；透析袋（截留量1000 Da）、DEAE-52 纖維素：上海源葉生物科技有限公司；Sephadex G-100 葡聚糖凝膠填料：美國Pharmacia 公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀（SYNERGY2）：美國BioTek 公司；全自動生化培養(yǎng)箱（ZSD-1270）：上海智城分析儀器有限公司；高速冷凍離心機（3K15）：德國Sigma 公司；高效液相色譜儀（LD-20 AD）：日本Shimadzu 公司；水浴鍋（HH-S）：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，pH自然。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：不溶性茯苓多糖10 g/L，（NH4）2SO45 g/L，NaCl 3 g/L，pH 自然。

1.4 方法

1.4.1 不溶性茯苓多糖的制備

向茯苓粉末中加入適量體積的無水乙醇，浸泡并攪拌12 h，重復操作2 次，40 ℃烘干，得到脫脂茯苓粉末。稱取適量干燥的脫脂茯苓粉末，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，沸水浴提取2 h，過濾，棄去濾液，收集殘渣重復提取2 次。向濾渣中按料液比1∶40（g/mL）加入0.5 mol/L NaOH 溶液，在4 ℃冰箱中靜置12 h，8 000 r/min 離心20 min，收集上清液，向上清液中加入冰醋酸，調節(jié)pH 值至7 左右，離心并收集膠狀沉淀，用超純水洗滌沉淀，真空冷凍干燥，得到不溶性茯苓多糖。

1.4.2 微生物降解不溶性茯苓多糖條件優(yōu)化

將琉球曲霉接種于斜面培養(yǎng)基，30 ℃活化48 h，將活化好的菌種接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)36 h，作為種子液備用。以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始發(fā)酵pH值、轉速、接種量為影響因子進行單因素試驗。固定發(fā)酵條件為發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30 ℃、初始發(fā)酵pH自然、轉速180 r/min，接種量10%。分別考察發(fā)酵時間（0、12、24、36、48、60、72 h）、發(fā)酵溫度（22、26、30、34、38 ℃）、初始發(fā)酵pH 值（4、5、6、7、8、9）、轉速（140、160、180、200、220 r/min）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對不溶性茯苓多糖降解率的影響。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，根據下列公式計算不溶性茯苓多糖降解率。

式中：D 為不溶性茯苓多糖降解率，%；m1為發(fā)酵液中水溶性茯苓多糖含量，g；m2為不溶性茯苓多糖質量，g。

1.4.3 水溶性茯苓多糖的純化

發(fā)酵結束后，8 000 r/min 離心20 min，收集上清液，濃縮。向濃縮后的發(fā)酵液中加入1/4 體積的Sevage試劑，重復脫蛋白3 次。將脫除蛋白后的粗多糖溶液醇沉，透析，凍干，得到粗水溶性茯苓多糖。

DEAE-52 離子交換柱層析：稱取粗水溶性茯苓多糖120 mg，溶于3 mL 超純水中，經0.45 μm 濾膜過濾后上樣至已處于平衡狀態(tài)的DEAE-52 纖維素層析柱（規(guī)格2.6 cm×40 cm）中，分別用0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl和超純水洗脫，流速0.5 mL/min，自動部分收集器收集，收集速度10 min/管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集洗脫液，透析，凍干。

Sephadex G-100 凝膠柱層析：稱取經離子交換柱層析分離得到的茯苓多糖樣品，加入適量超純水溶解，經0.45 μm 濾膜過濾后上樣至Sephadex G-100 凝膠層析柱（規(guī)格1.0 cm×40 cm）中，超純水為洗脫液進行洗脫并收集，流速0.3 mL/min，收集速度10 min/管，苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測，收集洗脫液，旋蒸濃縮，透析，真空冷凍干燥，得到純化的單一組分的水溶性茯苓多糖，命名為WPCP。

1.4.4 紅外光譜測定

采用KBr 壓片法進行水溶性茯苓多糖紅外光譜測定。稱取適量干燥的水溶性茯苓多糖，加入KBr 后在瑪瑙研缽中充分研磨，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外掃描。

1.4.5 分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography,HPGPC）測定水溶性茯苓多糖WPCP 分子量。稱取水溶性茯苓多糖10 mg，用0.1 mol/L 硝酸鈉溶液配制成1.0 mg/mL 的樣品溶液，0.22 μm 濾膜過濾后進行HPGPC 分析，每個樣品平行進樣3 次，記錄保留時間，按標準曲線計算相對分子質量。分子量標準曲線的回歸方程為y=-0.462 2x+10.137，R2=0.991 7。

HCGPC 條件：示差折光檢測器，WelchXtimateSEC-500 柱（7.8 mm×300 mm，5 μm），流動相為0.1 mol/L 硝酸鈉溶液，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL。

1.4.6 抗氧化活性測定

配制不同濃度的水溶性茯苓多糖樣品溶液，按照參考文獻[15-17]中的方法，分別測定其對DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率。

1.5 數據處理

取3 次試驗數據的平均值并計算其誤差，用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 微生物降解不溶性茯苓多糖條件優(yōu)化結果

不同發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始發(fā)酵pH 值、轉速及接種量對不溶性茯苓多糖降解率的影響見圖1～圖5。

由圖1 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，不溶性茯苓多糖的降解率逐漸提高，當發(fā)酵時間為36 h 時，菌株對不溶性茯苓多糖的降解率最高，達到53.97%，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，多糖降解率變化不明顯，故選擇36 h 作為菌株的發(fā)酵時間。

由圖2 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，不溶性茯苓多糖的降解率先升高后降低。當發(fā)酵溫度為26 ℃時，不溶性茯苓多糖的降解率最高，為56.88%，隨著溫度的進一步升高，不溶性茯苓多糖的降解率逐漸下降，推測是由于溫度較高影響了菌株的生長代謝，從而影響了多糖降解效率，故選擇26 ℃作為不溶性茯苓多糖降解的最適發(fā)酵溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對不溶性茯苓多糖降解率的影響Fig.2 The effect of fermentation temperature on degradation rate of insoluable PCP

由圖3 可知，初始發(fā)酵pH 值為4～7 時，隨著初始發(fā)酵pH 值的逐漸升高，不溶性茯苓多糖的降解率逐漸提高，當初始發(fā)酵pH 值為7 時，不溶性茯苓多糖的降解率最高，為57.46%，當pH 值繼續(xù)升高，不溶性茯苓多糖的降解率開始下降。說明在中性條件下，有利于菌株生長代謝，過酸或過堿的條件均不利于菌株生長代謝并降解不溶性茯苓多糖，故選擇pH 值為7 作為初始發(fā)酵pH 值。

圖3 初始發(fā)酵pH 值對不溶性茯苓多糖降解率的影響Fig.3 The effect of primary medium pH on degradation rate of insoluable PCP

由圖4 可知，隨著轉速的提高，不溶性茯苓多糖的降解率先升高后降低。當轉速為160 r/min 時，不溶性茯苓多糖的降解率最高，為58.27%，當轉速繼續(xù)增加時，產生過大的剪切力不利于菌絲體生長，不溶性茯苓多糖的降解率隨之下降，故選擇轉速為160 r/min。

圖4 轉速對不溶性茯苓多糖降解率的影響Fig.4 The effect of rotation speed on degradation rate of insoluable PCP

由圖5 可知，接種量為2%～8%，隨著接種量的增加，不溶性茯苓多糖的降解率逐漸增加，接種量為8%時，不溶性茯苓多糖的降解率最高，為60.25%，當接種量繼續(xù)增加時，不溶性茯苓多糖的降解率明顯下降，故選擇8%作為發(fā)酵降解不溶性茯苓多糖的最適接種量。

圖5 接種量對不溶性茯苓多糖降解率的影響Fig.5 The effect of inoculation volume on degradation rate of insoluable PCP

2.2 水溶性茯苓多糖純化結果分析

水溶性茯苓多糖經DEAE-52 離子交換柱層析分離后的洗脫曲線如圖6 所示。

圖6 DEAE-52 離子交換柱層析洗脫曲線Fig.6 Elution profiles of DEAE-52 cellulose column

由圖6 可知，經超純水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 洗脫后，得到2 個洗脫峰，經超純水洗脫得到洗脫峰1，經0.1 mol/L NaCl 洗脫得到洗脫峰2，洗脫峰峰形較為對稱，表明分離效果較好。由于洗脫峰2 中多糖含量較少，故選擇洗脫峰1 進行后續(xù)研究。

組分1 經Sephadex G-100 凝膠柱層析分離后的洗脫曲線如圖7 所示。

圖7 Sephadex G-100 凝膠柱層析洗脫曲線Fig.7 Elution profiles of Sephadex G-100 column

由圖7 可知，經葡聚糖凝膠層析柱分離后得到洗脫峰1-1，該洗脫峰高且對稱，表明分離效果較好，將洗脫液收集并凍干，得到相對均一的水溶性茯苓多糖（WPCP）組分。

2.3 紅外光譜結果分析

水溶性茯苓多糖WPCP 的紅外光譜如圖8 所示。

圖8 水溶性茯苓多糖WPCP 的紅外光譜Fig.8 The FT-IR spectrum of WPCP

由圖8 可知，3 384.5 cm-1處是非游離O-H 鍵的伸縮振動，2 929.3 cm-1處是糖類甲基、亞甲基C-H 鍵的伸縮振動，1 068.3 cm-1和1 035.6 cm-1處的吸收峰為C-O-C 鍵和C-OH 鍵的伸縮振動，869.1 cm-1處是β-D 糖苷鍵的特征吸收[10，18-19]。以上結果表明，水溶性茯苓多糖WPCP 具有一般糖類物質的特征結構。

2.4 分子量測定結果

水溶性茯苓多糖（WPCP）的凝膠滲透色譜圖如圖9 所示。

由圖9 可知，該樣品具有一個單一的對稱峰，說明僅含有一種分子量分布的多糖，其保留時間為13.256 min，根據標準曲線計算可知，該多糖的相對分子質量為1.51×104Da，本試驗制得的不溶性茯苓多糖利用黏度法測得的分子量為51.29×104Da，與不溶性茯苓多糖相比，WPCP 的分子量有了明顯下降。

圖9 水溶性茯苓多糖WPCP 的凝膠滲透色譜圖Fig.9 Gel permeation chromatography of WPCP

2.5 水溶性茯苓多糖抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH 自由基清除能力分析

水溶性茯苓多糖（WPCP）對DPPH 自由基的清除能力如圖10 所示。

圖10 WPCP 對DPPH 自由基清除能力Fig.10 Scavenging ability of DPPH radical on WPCP

由圖10 可知，隨著WPCP 濃度不斷增加，其對DPPH 自由基的清除率也逐漸提高，但對DPPH 自由基的清除能力小于VC，未降解的不溶性茯苓多糖（PCP）對DPPH 自由基幾乎不具有清除能力。當WPCP 的濃度為4 mg/mL 時，其對DPPH 自由基的清除率達到了59.10%，WPCP 的IC50為3.79 mg/mL，說明降解后的WPCP 活性基團暴露，可以作為供氫體清除DPPH 自由基[20]。

2.5.2 羥自由基清除能力分析

水溶性茯苓多糖（WPCP）對羥自由基的清除能力如圖11 所示。

圖11 WPCP 對羥自由基清除能力Fig.11 Scavenging ability of hydroxyl radical on WPCP

由圖11 可知，隨著WPCP 濃度的增加，其對羥自由基的清除率逐漸提高，具有一定的濃度相關性，在8 mg/mL 時，PCP、WPCP、VC對羥自由基的清除率分別為1.32%、57.1%、99.41%，其中，WPCP 的IC50為6.10 mg/mL。試驗結果表明，多糖的溶解性對抗氧化功能的提高至關重要，多糖溶解性提高有利于抑制羥自由基的產生[21]。

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力分析

超氧陰離子自由基的化學性質非常活潑，在生物體內，超氧陰離子自由基容易轉化為羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等，產生氧化應激損傷[22-23]。WPCP 對超氧陰離子自由基的清除能力如圖12 所示。

圖12 WPCP 對超氧陰離子自由基清除能力Fig.12 Scavenging ability of superoxide anion free radical on WPCP

由圖12 可知，WPCP 對超氧陰離子自由基的清除能力隨濃度的增加而增加。當濃度為4 mg/mL 時，PCP、WPCP、VC對超氧陰離子自由基的清除率分別為1.53%、50.16%、96.56%，其中，WPCP 的IC50為3.99 mg/mL。試驗結果表明，多糖溶解性的提高對抑制超氧陰離子自由基的產生具有促進作用，且具有一定的濃度相關性。

3 結論

本文利用琉球曲霉對不溶性茯苓多糖進行發(fā)酵降解，通過單因素試驗獲得最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度26 ℃、初始發(fā)酵pH 值7、轉速160 r/min、接種量8%，在最佳發(fā)酵條件下，不溶性茯苓多糖的降解率為60.25%。通過分離純化，得到一種相對分子質量為1.51×104Da 的水溶性茯苓多糖，與不溶性茯苓多糖相比，該多糖分子量降低，溶解性提高，抗氧化能力得到改善。