伏牛山區六妹羊肚菌揮發性呈香物質分析

劉娜娜，程曉，潘珍珍，楊曉冰，3，李秀紅*

（1.三門峽職業技術學院，河南 三門峽 472000；2.西北農林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100；3.河南科技大學應用工程學院，河南 三門峽 472000）

羊肚菌（Morchella esculenta）是一種真菌，又稱羊肚菜、羊蘑等，因其形狀類似羊肚而得名，是名貴食材“草八珍”之一，富有“素中之葷”的美稱，羊肚菌生長分布遍布世界各地，因產量較少而愈顯珍貴。羊肚菌的食用歷史悠久，具有化痰理氣、補腦提神、潤胃健脾、補腎強身等功效。現代研究表明，羊肚菌含有多種氨基酸、脂肪酸、多糖和核苷酸等營養物質為人體所需，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗疲勞以及抗氧化等功效[1-2]，研究發現羊肚菌中生物活性物質具有抗炎、降血糖、預防動脈粥樣硬化等生理功效[3]。羊肚菌除了具有較高的營養價值，同時還擁有獨特的風味，經過熬制后的羊肚菌湯色澤良好，味道鮮美[4]。通過炒醬和熬制等加工工藝，可將羊肚菌與其它食材進行合理配比制成風味食品，如羊肚菌牛肉醬，羊肚菌豬骨湯等，有利于更大程度發揮羊肚菌的子實體風味價值。

通常食用菌風味由香味和滋味組成，分別作用于嗅覺和味覺器官，食用菌的香味來源于酸類、醛類、酮類、酯類等揮發性物質，因這些物質易于揮發到空氣中，進而引起嗅覺反應，另一些非揮發性滋味物質，主要成分包括呈味氨基酸、可溶性糖、糖醇、5'-核苷酸、有機酸等，可引起舌頭的味覺反應[5-6]。有文獻報道我國川藏地區與長白山地區所產羊肚菌的揮發性和非揮發性呈味物質的組成，發現不同地區羊肚菌的呈味物質有所不同，研究表明氣相-離子遷移譜檢測技術對羊肚菌的風味化合物分析可區分羊肚菌的不同產地[7-9]。為了分析我國中原地區羊肚菌的風味組成，本試驗選取產自秦嶺北麓河南三門峽伏牛山地區的六妹羊肚菌品種為試驗材料，通過多種頂空吸附萃取條件對羊肚菌的揮發性成分進行收集，再進行氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以明確本地區羊肚菌的揮發性呈香物質組分，為該地區六妹羊肚菌的功能性食品藥品開發與產業的精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六妹羊肚菌：三門峽九龍山農業科技有限公司。將羊肚菌干品粉碎處理，過40、100、200 目篩，-20 ℃保存。

3-壬酮：武漢浩榮生物科技有限公司；氯化鈉、濃硫酸：西隴科學股份有限公司；葡萄糖、無水乙醇、無水乙醚：天津永大化學試劑有限公司；濃鹽酸、苯酚：成都科隆化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

SZ-TR320 型消解爐：德國默克公司；KL-SWCK6型馬弗爐：鶴壁科力測控技術有限公司；KjeltecTM 8400 型全自動凱氏定氮儀：丹麥福斯集團公司；ISQ&TRACEISQ 型氣質聯用儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；DP-D501 型冷凍干燥機：深圳德普儀器有限公司；AUY200 型分析天平：上海精密儀器儀表有限公司；GFL-230 型烘箱：天津萊玻特瑞儀器設備有限公司；HC-3018 型高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌基本成分鑒定

水分含量測定：參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法。

粗脂肪含量測定：參考GB5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中酸水解法。

灰分含量測定：參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》中灰分測定法。

蛋白質測定：取樣品0.2 g 于消化管中，再加入3 g催化劑（硫酸銅∶硫酸鉀=1∶9，質量比）和5 mL 硫酸后，于消解爐進行消化。當溫度達到420 ℃后，繼續消化3 h，使其自然冷卻至室溫，將消化管取出，隨后在全自動凱氏定氮儀上測定。

粗多糖測定：采用苯酚-濃硫酸法，首先繪制標準曲線。將10 mg 葡萄糖溶解并定容于100 mL 容量瓶（葡萄糖濃度0.1 g/L），取試管6 支，分別裝入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖溶液，補充蒸餾水至2.0 mL，然后各試管再分別加入1 mL 5%苯酚、5 mL 濃硫酸，將試管置于沸水浴中處理15 min 后，取出試管，水浴降溫至室溫，在490 nm 下測定樣品吸光值。采用Origin 回歸分析，得到線性回歸方程，并繪制方程曲線，橫坐標為多糖濃度X（μg/mL），縱坐標為吸光值Y，即得到葡萄糖標準曲線。建立標準曲線方程為Y=0.005 2X-0.004 1，R2=0.998 7。

稱取1 g 羊肚菌粉，按料液比1∶51（g/mL）混合，水浴恒溫46 ℃提取，提取時間3.5 h，4 000 r/min 離心10 min，得到上清提取液，將提取液于100 mL 容量瓶定容得樣品液。樣品液取0.1 mL 放入試管，處理方法與標準液相同，獲得處理液在490 nm 處的吸光值后，通過標準曲線方程計算出多糖濃度，帶入公式（1），經計算即可獲得羊肚菌中粗多糖的含量。

式中：W 為多糖含量，%；C 為多糖濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；N 為稀釋倍數；M 為樣品質量，g。

1.2.2 揮發性呈味物質測定

參考殷朝敏等[10]的方法稍作修改，試驗通過選取多種萃取條件，以達到充分獲取揮發性物質的目標。羊肚菌子實體經破碎為不同粒度（40、100、200目），分別稱取不同粒度羊肚菌干粉樣品1.5 g 置于40 mL 采樣瓶中，加蒸餾水10 mL、NaCl 1.5 g，再加入32.64 μg/mL 3-壬酮10 μL 作為內標。樣品混勻，使用聚四氟乙烯隔熱墊密封瓶口，在試驗設置的溫度下（50、60、70 ℃）分別采用磁力攪拌平衡10 min，再用預先老化好的萃取頭頂空吸附，吸附完成后，將萃取頭置于氣相色譜-質譜聯用儀進樣口解吸，解吸溫度250 ℃，時間2.5 min，然后進行GC-MS 分析。

GC 條件：色譜柱為Innowax 極性毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序中初始溫度40 ℃，保持2 min；升溫速度3 ℃/min，升至180 ℃時保持2 min，然后升溫速度為10 ℃/min，升至260 ℃保持1 min；載氣為高純度氦氣，氣體流速為1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，不分流。

MS 條件：使用電子電離源；電子能量為70 eV，電壓350 V，質量掃描范圍50～450 m/z；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.2.3 關鍵風味化合物評定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value,ROAV）評定羊肚菌樣品中的關鍵風味化合物，參考劉登勇等[11]的方法，首先計算各揮發性組分的氣味活度值（odor activity value，OAV），確定對香氣貢獻最大的組分，其公式如下。

式中：O 為各揮發組分的氣味活度值，%；C 為風味物質的含量，μg/kg；T 為該物質的嗅覺閾值，μg/kg。

根據OAV 結果，值最大的定義對香氣貢獻最大，該物質組分相對氣味活度值為100，其它風味物質按下列公式計算相對氣味活度值。

式中：Ri代表各組分ROAV；Oi和Omax分別為各化合物組分的OAV；Ci為各組分的含量，μg/kg；Ti為各組分的感覺閾值，μg/kg。

樣品中某種風味物質ROAV 越大，那么在總體風味該物質的貢獻也越大。一般認為樣品的關鍵風味物質為1≤ROAV≤100 的組分。此外，對總體風味具有重要修飾作用的物質為0.1≤ROAV＜1.0 的組分。

1.3 數據統計與分析

儀器檢索系統利用標準譜庫對GC-MS 總離子流圖的各峰進行比對分析，以對比度90%為基準，結合標準質譜圖和保留時間來確認各揮發性化合物的種類和總量。數據統計和分析使用Microsoft Excel 2007進行，柱形圖的繪制使用GraphPad Prism 9 軟件。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌常規組分分析

羊肚菌常規組分含量如表1 所示。

表1 羊肚菌（干品）常規組分含量Table 1 Basic nutrients in Morchella sextelata（dried）

從表1 可以看出，羊肚菌的蛋白質含量較高，為36.33%，粗多糖和粗脂肪含量較低，粗脂肪含量僅有1.34%。

2.2 萃取結果分析

不同萃取條件下有效峰面積占比見表2。

表2 不同萃取條件下有效峰面積占比Table 2 Ratio of effective peak area under different extraction conditions

由表2 可知，鑒定出揮發性物質最多的條件為100 目60 ℃40 min 和100 目50 ℃60 min，均鑒定出43 種物質。相同溫度、相同萃取時間下，樣品破碎至40目萃取富集揮發物的效果較差，鑒定出的物質種類和含量較少，樣品粉碎目數越高，萃取獲得的揮發物含量越高。在100 目粉碎條件下，萃取溫度60 ℃，萃取40 min 或60 min 的有效峰面積差異不大，在40 min 時已基本完成對有效物質的采樣、富集，但隨著時間的延長，總峰面積稍有增加，但同時也使雜質被萃取的可能性增加。在100 目粉碎條件下，萃取相同時間，隨著萃取溫度的變化有效峰面積也隨之變化，50 ℃和60 ℃的有效峰面積差異較小。由于高溫能夠促使一些化合物降解，進而產生小分子揮發物，試驗中以70 ℃條件下的有效峰面積最大，推測70 ℃條件下有部分高分子物質分解，但高溫條件下的數據有助于分析烹飪條件下的揮發性物質組成。

2.3 揮發性物質組分分析

不同萃取條件下羊肚菌干品揮發性成分的組成和含量見表3。各類組分總量統計圖見圖1。

圖1 揮發性物質組分與含量統計圖Fig.1 Content of volatile components

表3 不同萃取條件下羊肚菌干品揮發性成分組成及含量Table 3 Content of volatile components of dried Morchella sextelata extracted under different conditions

由表3 可知，試驗總共鑒定出的62 種化合物，包括18 種醛類、12 種醇類、2 種酸類、4 種酯類、8 種酮類、1 種烯烴類、11 種烷烴類、2 種炔類、3 種芳香烴類、1 種呋喃類，并經過色譜軟件的計算獲得了相應化合物的精確含量。經統計分析，圖1 顯示出揮發性化合物中含量較多的化合物主要是醛類化合物與烷烴類化合物。由表3 可知，在100 目60 ℃40 min 的萃取條件下，烷烴類與醛類化合物總含量均達到5 000 μg/kg，揮發性化合物中1，3-二溴丙烷含量最多，含量為6 954.59 μg/kg。在幾種萃取方案中，烷烴類、醛類均為揮發性化合物的主要組分，且以1，3-二溴丙烷含量最多。綜合色譜分析結果發現化合物1，3-二溴丙烷在羊肚菌干品分離的保留時間為31.00 min 左右，含量在4207.86～8304.31 μg/kg 之間。1，3-二溴丙烷是重要的揮發性成分之一，由于該物質無嗅而口感略帶甜味，因此對嗅覺風味沒有明顯影響。此外在本試驗條件下，鑒定出了幾種含量較高且對羊肚菌風味有潛在影響的化合物，如正己醛、正壬醛、癸醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、正己醇、正己酸、2-壬酮、香葉基丙酮、1-溴-3-氯丙烷等，這些化合物對風味的貢獻本試驗采用相對氣味活度值進行了評價。

2.4 關鍵風味化合物評定

根據試驗方法中的計算公式，本試驗統計和分析了羊肚菌中所有揮發性化合物的相對氣味活度值，具有風味影響的揮發性化合物見表4。

表4 羊肚菌中ROAV＞0.1 的揮發性物質及其氣味特征Table 4 Odor characteristics of M.sextelata volatile substances with ROAV＞0.1

由表4 可知，羊肚菌（干制品）中的關鍵風味化合物有14 種，分別為2-甲基丁醛、異戊醛、正己醛、正壬醛、E-2-辛烯醛、癸醛、苯乙醛、椰子醛、反-2-壬烯醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、正己酸、2-壬酮、香葉基丙酮。其中ROAV 最大的化合物為癸醛，其次為反-2-壬烯醛、香葉基丙酮、正己醇。癸醛的風味在稀釋時有甜橙和橘子香氣，并帶有油脂氣息，其成分天然存在于柑橘、檸檬、園柚、西紅柿、草莓中[12]，本試驗不同萃取條件下的樣品中癸醛的含量均較高（612.78～1 134.45 μg/kg）。反-2-壬烯醛帶有一些黃瓜味和柑橘味，因其氣味閾值很低而在本試驗中呈現較高的ROAV。香葉基丙酮具有新鮮、清、淡的花香香氣，而正己醇具有特殊香味。此外，對總體風味具有重要修飾作用的風味物質主要有2-庚烯醛、甲基壬基甲酮、2-戊基呋喃。

3 討論與結論

關于羊肚菌中的常規組分含量，試驗對六妹羊肚菌基本組分的分析發現，其蛋白質含量達36.33%，是名副其實的高蛋白食品。一些食用菌的研究表明，真菌類食品中普遍含有較高的蛋白質，文獻報道的幾種食用真菌蛋白質含量，如香菇（21.90%）、金針菇（18.30%）、茶樹菇（26.07%）、黑木耳（11.20%）[13]、順昌菌草竹蓀（24.01%）、竹屑竹蓀（19.47%）[14]、雞杉（24.2%）、松靈芝（26.6%）、冬蟲夏草（29.1%）等[15]，相比之下，本試驗羊肚菌的蛋白質含量屬于真菌食品中較高的一類。另外本試驗中所測定羊肚菌的粗脂肪、粗多糖含量僅有1.34%、6.93%，屬于低脂低糖食品。

食用菌中的嗅覺致香物質即風味因子來自于主體揮發性香氣成分，是食用菌的決定性風味因子。不同生態環境造成的生物代謝差異可導致食用菌的風味因子不同，例如同一品種羊肚菌，來自川西高原的含有二十烷，來自成都平原的含有1-辛烯-3-醇，而丘陵地區樣品含二硫化合物等[16]。長白山、林芝羊肚菌風味化合物特征峰與青川、香格里拉產地的羊肚菌差異較大[7]。本試驗的羊肚菌樣品來自華北平原西部的秦嶺北麓（三門峽市伏牛山區），樣品中也檢測出與成都平原羊肚菌樣品相同的1-辛烯-3-醇是關鍵風味化合物成分之一。

羊肚菌的揮發性物質會在不同的烹制條件下逐步揮發出來，付瑞青等[17]對羊肚菌在煮制過程中共收集到49 種揮發性風味物質，一些風味物質在煮制的不同時間出現。考慮到在不同的溫度條件下，食用蕈揮發出的香氣成分會受到影響并發生變化[18]，因此本試驗嘗試通過改變的條件參數，盡可能完全地把同一種羊肚菌中所存在的揮發性呈味物質全部檢測出來，結果顯示本試驗共鑒定出62 種揮發性物質，單一條件下獲得羊肚菌揮發性物質最多達到43 種。

李翔等[8]在野生和人工栽培羊肚菌菌蓋干品中，共檢測出42 種揮發性成分，其中野生品種中以正己醛（17.99%）含量最高，人工栽培羊肚菌中以甲酸己酯（7.86%）含量最高。謝麗源等[19]對栽培品種川羊肚菌的分析發現其揮發性物質主要包括7 類，以醛類化合物比例最高，其次是酯、醇、烴化合物、含硫化合物等，并有少量酮、呋喃。本試驗獲得的GC-MS 圖譜中，鑒定出的風味化合物以醛類總含量最高，其次還有醇類、酸類、酯類、酮類和烴類。揮發性化合物對風味組成的貢獻是由該揮發性物質的含量和氣味閾值共同決定，所以相對含量高的揮發性化合物不一定是對香氣貢獻大的化合物。如本試驗中揮發性物質以1，3-二溴丙烷的含量最高，但此物質在羊肚菌風味中的貢獻在于味覺。研究表明食用菌鮮味主要來源于氨基酸類鮮味物質和呈味核苷酸，例如蘑菇的鮮味一部分來自5'-核苷酸，當蘑菇與其他食材一起烹飪，5'-核苷酸不僅提供鮮味來源，還對其他食材的甜味、肉味有增效作用，同時抑制食材中的不愉快味道如咸、酸、苦味等[20]。因此對于羊肚菌的風味分析，除了揮發性香味物質，其入口滋味的組成也值得進一步研究。

本試驗以羊肚菌為研究對象，通過測定羊肚菌基本物質組分含量，結果顯示羊肚菌具有富含蛋白質、低脂肪、低糖的特點。通過不同前處理結合頂空固相微萃取，對羊肚菌的揮發物成分進行收集，再使用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對收集到的羊肚菌揮發性物質進行分析，共鑒定出62 種揮發性物質，主要包括18 種醛類、12 種醇類、2 種酸類、4 種酯類、8 種酮類、1 種烯烴類、11 種烷烴類、2 種炔類、3 種芳香烴類和1 種呋喃類。經ROAV 評價方法分析，認為試驗羊肚菌的關鍵風味化合物有14 種，貢獻最大的是癸醛，有甜橙和橘子香氣，其次是反-2-壬烯醛、香葉基丙酮、正己醇，具有修飾作用的化合物有3 種。

羊肚菌的開發與利用離不開對羊肚菌的基礎研究，探究羊肚菌香氣和滋味的關鍵組成，有助于發掘羊肚菌風味的形成機理，進而對羊肚菌關鍵組分的提取與利用提供基礎，促進羊肚菌的產品深加工，形成羊肚菌特有的風味產品。本試驗解析了羊肚菌風味特征中的呈香化合物，有助于理解羊肚菌的風味特點，對羊肚菌的深加工、羊肚菌的定向種植有一定的理論指導意義。